微生物的生長繁殖及其控制.ppt

第四章 微生物的生長繁殖及其控制 1.1 微生物的營養(yǎng)要素 1.1.1 微生物細(xì)胞的化學(xué)組成 微生物細(xì)胞 水：70%-90% 干物質(zhì) 有機(jī)物 蛋白質(zhì)、糖、脂、核酸、維生素等 及其降解產(chǎn)物 無機(jī)物（鹽） 微生物、動物、植物之間存在“營養(yǎng)上的統(tǒng)一性” 細(xì)胞化學(xué)元素組成： 主要元素：碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鎂、鈣、鐵等； 微量元素：鋅、錳、鈉、氯、鉬、硒、鈷、銅、鎢、鎳、硼等。 1、微生物營養(yǎng) 1.1.2元素在細(xì)胞內(nèi)存在形式： 上述元素主要以水、有機(jī)物、無機(jī)鹽的形式存在于細(xì)胞中： 有機(jī)物：蛋白質(zhì)、糖、脂類、核酸、 維生素及其降解產(chǎn)物. 無機(jī)物：1)參與有機(jī)物組成， 2)單獨(dú)存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以無機(jī)鹽的形式存在. 水：約占細(xì)胞總重70%90%，以游離水和結(jié)合水兩種形式存 在 游離水：干重法可測得； 結(jié)合水：不易蒸發(fā)、不凍結(jié)、也不能滲透, 占水總量的17%28% 。 1.1.3微生物細(xì)胞化學(xué)組成含量的變化 主要成分 細(xì)細(xì)菌 酵母菌 霉菌 水分 7585 7080 8590 （占細(xì)細(xì)胞鮮鮮重的%） 蛋白質(zhì)質(zhì) 5080 3275 1415 占 細(xì)細(xì) 碳水化合物 1228 2763 740 胞 干 脂肪 520 215 440 重 的 核酸 1020 6 8 1 % 無機(jī)鹽鹽 230 3.87 612 微生物細(xì)胞的化學(xué)組成 此組成可因菌種的種類、菌齡、培養(yǎng)基組成、培 養(yǎng)條件、分析方法等而有所不同。 1.2 營養(yǎng)物質(zhì)及其生理功能 微生物與動植物營養(yǎng)要素的比較 微生物生長所需要六大營養(yǎng)要素： 碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、水、能源 1.2.1 1.2.1 碳源（碳源（Carbon sourceCarbon source） 定義：凡可被用來構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn) 物中碳素來源的營養(yǎng)物質(zhì)。 功能：提供合成細(xì)胞物質(zhì)及代謝物的原料;并為整個(gè) 生理活動提供所需要能源（異養(yǎng)微生物）。 種類: 無機(jī)含碳化合物：如CO2和碳酸鹽等。 有機(jī)含碳化合物：糖與糖的衍生物（多糖：如淀粉、 麩皮、米糠等；飴糖；單糖）,脂類、 醇類。有機(jī)酸、烴類、芳香族化合物 以及各種含氮的化合物。 類類 型 元素水平 化合物水平 培養(yǎng)基原料水平 有 機(jī) 碳 CHONX復(fù)雜雜蛋白質(zhì)質(zhì)、核酸等牛肉膏、蛋白胨胨、花生餅餅 粉等 CHON多數(shù)氨基酸、簡單簡單 蛋白 質(zhì)質(zhì)等 一般氨基酸、明膠等 CHO糖、有機(jī)酸、醇、脂類類 等 葡萄糖、蔗糖、各種淀粉、 糖蜜等 CH烴類烴類天然氣、石油及其不同餾餾份 、石蠟油等 無 機(jī) 碳 C(?) COCO2CO2 COXNaHCO3NaHCO3、CaCO3、等 微生物的碳源譜 微生物工業(yè)發(fā)酵中用做碳源的原料 傳統(tǒng)種類：糖類（單糖，飴糖） 淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物 淀粉等） 麩皮 各種米糠等 代糧發(fā)酵：纖維素、石油、CO2、H2 凡用來構(gòu)成菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)源。 種類：無機(jī)氮：銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、 尿素、 氨、N2等； 有機(jī)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物（如胨、肽、 氨基酸等）、牛肉膏、魚粉、花生餅粉、 黃豆餅粉、玉米漿等 功能： 1）提供合成細(xì)胞中含氮物，如蛋白質(zhì)、核酸，以及含氮代謝 物等的原料； 2）少數(shù)細(xì)菌可以銨鹽、硝酸鹽等氮源為能源。 1.2.2氮源（Nitrogen source ）： 類類 型 元素水平化合物水平培養(yǎng)基原料水平 有 機(jī) 氮 NCHOX復(fù)雜雜蛋白質(zhì)質(zhì)、核酸等牛肉膏、酵母膏、餅餅 粕粉、蠶蛹粉等 NCHO尿素、一般氨基酸、簡單簡單 蛋 白質(zhì)質(zhì)等 尿素、蛋白胨胨、明膠 等 無 機(jī) 氮 NHNH3、銨鹽銨鹽 等(NH4)2SO4等 NO硝酸鹽鹽等KNO3等 NN2空氣 微生物的氮源譜 硝酸鹽NO3 NH4+ 實(shí)驗(yàn)室常用的無機(jī)氮源: 有碳酸銨、硝酸鹽、硫酸銨、尿素、蛋白胨、牛肉膏 、酵母膏等。生產(chǎn)上常用的氮源有硝酸鹽、銨鹽、尿素、氨以及蛋白含量較高的 魚粉、蠶蛹粉、黃豆餅粉、花生餅份、玉米漿等。 蛋白氮必須通過水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被機(jī)體利用，這種氮源叫 遲效氮源。 無機(jī)氮源或以蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物形式存在的有機(jī)氮源可以直接被菌體吸收利用，這種 氮源叫做速效氮源。 速效氮源，通常有利于機(jī)體的生長，遲效氮源有利于代謝產(chǎn)物的形成。 銨 鹽 氨基酸入胞 細(xì)胞物質(zhì) 蛋白胨 豆 餅 蠶蛹粉 分解 入胞 細(xì)胞物質(zhì) 誘導(dǎo)酶 誘導(dǎo)酶 1.2.3無機(jī)鹽（inorganic salt） 定義：為微生物細(xì)胞生長提供碳、氮源以外的多種重要元素（ 包括大量元素和微量元素）的物質(zhì)，多以無機(jī)鹽的形式共給。 大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （微生物生長所需濃 度在10-310-4mol/L） 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （微生物生長所需濃度在 10-610-8mol/L） 一般微生物生長所需要的無機(jī)鹽有：硫酸鹽、磷酸鹽、 氯化物以及含有鈉、鉀、鎂、鐵等金屬元素的化合物。 無機(jī)鹽的生理功能 無 機(jī) 鹽 大量 元素 微量 元素 一般功能 特殊功能 酶的激活劑（Cu2+、Mn2+、Zn2+等） 特殊分子結(jié)構(gòu)成分（Co、Mo等） 維持滲透壓 生理調(diào)節(jié)物質(zhì)酶的激活劑 pH的穩(wěn)定 化能自養(yǎng)菌的能源(S、Fe2+、 NH4+、NO2-) 無氧呼吸時(shí)的氫受體(NO3-、 SO42-) 細(xì)胞內(nèi)一般分子成分(如P，S， Ca，Mg，F(xiàn)e等) 生理酸式鹽和生理堿式鹽生理酸式鹽和生理堿式鹽 (NH4)2SO42NH4+ + SO42- 入胞pH K+（Na+）+ NO3- 入胞pH KNO3 NaNO3 NH4NO3NH4+(先入胞)+ NO3-(后入胞) 1.2.4 生長因子（growth factor）： 定義:是一類對微生物正常生活所不可缺少而需要量又不 大，但微生物自身不能用簡單的碳源或氮源合成，或合成 量不足以滿足機(jī)體生長需要的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)。不同微生物 需求的生長因子的種類和數(shù)量不同。 缺乏合成生長因子能力的微生物稱為“營養(yǎng)缺陷型”微生 物。 嘌呤和嘧啶：用于合成核酸 (DNA and RNA) 氨基酸：蛋白質(zhì)合成 維生素：構(gòu)成酶的輔基或輔酶 根據(jù)微生物對生長因子的需要存在差異， 可分為： 野生型(wild type) 原養(yǎng)型 不需要生長因子而能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 上生長的菌株 營養(yǎng)缺陷型(auxotroph) 由于自發(fā)或誘發(fā)突變等原因從野生 型菌株產(chǎn)生的需要提供特定生長素物 質(zhì)才能生長的菌株 1.2.5 水 水是微生物最基本的組成分（7090） 水是微生物體內(nèi)和體外的溶劑（吸收營養(yǎng)成分和代謝廢物） 水是細(xì)胞質(zhì)組分，直接參與各種代謝活動 調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定（比熱高，傳熱快） 2、微生物的營養(yǎng)類型 異養(yǎng)型生物 自養(yǎng)型生物 生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì) 生物生長過程中能量的來源 光能營養(yǎng)型 化能營養(yǎng)型 光能自養(yǎng)型：以光為能源，不依賴任何有機(jī)物即可正常生長 光能異養(yǎng)型：以光為能源，但生長需要一定的有機(jī)營養(yǎng) 化能自養(yǎng)型：以無機(jī)物的氧化獲得能量，生長不依賴有機(jī)營養(yǎng)物 化能異養(yǎng)型：以有機(jī)物的氧化獲得能量，生長依賴于有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì) 以C02作為唯一碳源或主要碳源，并利用光能，以無機(jī)物如硫化氫 、硫代硫酸鈉或其他無機(jī)硫化物作為供氫體將CO2還原成細(xì)胞物質(zhì) ，同時(shí)產(chǎn)生元素硫 光能 CO2H2S CH2O+2S+H2O 光合色素 光能自養(yǎng)型微生物包括藍(lán)細(xì)菌（含葉綠素）、紅硫細(xì)菌和綠硫 細(xì)菌等少數(shù)微生物（含細(xì)菌葉綠素），由于含有光合色素，因而 能使先能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能（ATP），供機(jī)體直接利用。 2.1光能自養(yǎng)型微生物 2.2 光能異養(yǎng)型微生物 以CO2為主要碳源或唯一碳源，以有機(jī)物（如異丙醇）作為供氫體， 利用光能將CO2還原成細(xì)胞物質(zhì)，紅螺菌屬中的一些細(xì)菌屬于此種營 養(yǎng)類型。 光能 2(H3C)2CHOH+CO2 2CH3COCH3+CH2O+H2O 光合色素 光能異養(yǎng)型細(xì)菌在生長時(shí)大多數(shù)采要外源的生長因子 2.3 化能無機(jī)自養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型） 生長所需要的能量來自無機(jī)物氧化過程中放出的化學(xué)能； 以CO2或碳酸鹽作為唯一或主要碳源進(jìn)行生長時(shí)，利用H2、H2S、 Fe2+、NH3或NO2-等作為電子供體使CO2還原成細(xì)胞物質(zhì)。 化能無機(jī)自養(yǎng)型只存在于微生物中，可在完全無機(jī)及無光的 環(huán)境中生長。它們廣泛分布于土壤及水環(huán)境中,參與地球物質(zhì)環(huán)； 這類微生物主要有硫化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、氫細(xì)菌與鐵細(xì)菌。 它們在自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中起著重要的作用。 通過氧化無機(jī)物取得能量，并以 CO2為唯一或主要碳源 硝化細(xì)菌: 亞硝化細(xì)菌 : 2NH4+ +3O22NO2- +2H2O + 4H+132Kcal 硝化細(xì)菌: NO2- +1/2O2 NO3- +18.1 Kcal 硫化細(xì)菌: 通過氧化還原態(tài)的無機(jī)硫化物（H2S、S、 S2O32 - 、SO32-）獲得能量（硫桿菌屬，硫微螺菌屬） H2S + 1/2 O2 S +H2O + 50.1 Kcal S + 1 1/2 O2+H2O H2SO4+149.8 Kcal 鐵細(xì)菌：氧化Fe2+為Fe3+獲取能量并同化CO2 2Fe2+1/2O2+2H+ 2Fe3+H2O+21.2 Kcal 氫細(xì)菌：具有氫化酶，從氫的氧化獲取能量，同化CO2 H2+ 1/2 O2 H2O + 56.7 Kcal 多數(shù)微生物屬于化能異養(yǎng)型，其生長所需要能量和 碳源通常來自同一種有機(jī)物。 根據(jù)化能異養(yǎng)型微生物利用有機(jī)物的特性，又 可以將其分為下列兩種類型： 腐生型微生物：利用無生命活性的有機(jī)物作為 生長的碳源。 寄生型微生物：寄生在生活的細(xì)胞內(nèi)，從寄生 體內(nèi)獲得生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。 存在于寄生與腐生之間的中間過渡類型微生物 ，稱為兼性腐生型或兼性寄生型。 2.4 化能異養(yǎng)型微生物 3.微生物培養(yǎng)基 定義：應(yīng)科研或生產(chǎn)的需要，由人工配制的、適合 于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物用的營養(yǎng)基 質(zhì)（混合養(yǎng)料）。 特點(diǎn)：任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的五大營 養(yǎng)要素，且應(yīng)比例適當(dāng)。所以一旦配成必須立即滅 菌。 用途：促使微生物生長；積累代謝產(chǎn)物；分離微生 物菌種；鑒定微生物種類；微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)；菌種 保藏；制備微生物制品 培養(yǎng)基幾乎是一切對微生物進(jìn)行研究和利用工作的基礎(chǔ) 任何培養(yǎng)基都應(yīng)該具備微生物生長所需要六大營養(yǎng)要素： 碳源、氮源、無機(jī)鹽、能源、生長因子、水 任何培養(yǎng)基一旦配成，必須立即進(jìn)行滅菌處理； 常規(guī)高壓蒸汽滅菌： 1.05kg/cm2,121.315-30分鐘；0.56kg/cm2,112.615-30 分鐘某些成分進(jìn)行分別滅菌； 過濾除菌； 3.1.1培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營養(yǎng)特點(diǎn) 即根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基。 不同營養(yǎng)類型的微生物，其對營養(yǎng)物的需求差異很大。 如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應(yīng)該）由簡單的無機(jī) 物質(zhì)組成。異養(yǎng)做生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機(jī)物質(zhì) ，但有機(jī)物的種類需適應(yīng)所培養(yǎng)菌的特點(diǎn)。 按微生物的主要類群來說，它們所需要的培養(yǎng)基成分也 不同： 細(xì)菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 LB (Luria-Bertani) 放線菌： 高氏一號培養(yǎng)基 真菌： 查氏合成培養(yǎng)基 PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌； 麥芽汁 當(dāng)對試驗(yàn)菌營養(yǎng)需求特點(diǎn)不清楚的時(shí)候，可以采用生長譜法進(jìn)行測定。 3.1 培養(yǎng)基的配制原則 3.1.2營養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng) 濃度過高微生物的生長起抑制作用， 濃度過小不能滿足微生物生長的需要。 碳氮比（C/N）直接影響微生物生長與繁殖及代謝物 的形成與積累，故常作為考察培養(yǎng)基組成時(shí)的一個(gè)重 要指標(biāo)； 速效性氮（或碳）源與遲效性氮（或碳）源的比例 各種金屬離子間的比例 碳源中的碳原子的mol數(shù) 氮源中所含的氮原子的mol數(shù) C/N比值= 例：谷氨酸生產(chǎn)中 C/N 4/1時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少； C/N3/1 時(shí)，菌體生長受抑制，而谷氨酸大量增加 。 3.1.3 物理化學(xué)條件適宜 （A）pH: 各類微生物的最適生長pH值各不相同： 細(xì) 菌：7.08.0放線菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0霉 菌：4.05.8 在微生物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用 和代謝產(chǎn)物的形成與積累，培養(yǎng)基的初始pH值會發(fā)生改 變，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定，通常采用下列兩 種方式： 內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽； 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。 外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要不斷向發(fā)酵液流加酸或堿液 磷酸緩沖液：pH值從6.07.6之間 K2HPO4+HCl KH2PO4+KCl KH2PO4+KOH K2HPO4+H2O 加入CaCO3： CO32 HCO3 H2CO3 CO2+H2O +H+ H +H+ H 培養(yǎng)基中所含氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)也可起到緩沖作用 。 （B）滲透壓和aw 滲透壓 等滲溶液 適宜微生物生長 高滲溶液 細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離 低滲溶液 細(xì)胞吸水膨脹，直至破裂 大多數(shù)微生物適合在等滲的環(huán)境下生長，而有的菌如 Staphylococcus aureus則能在3mol/L NaCl的高滲 溶液中生長。能在高鹽環(huán)境（2.86.2/L NaCl）生 長的微生物常被稱為嗜鹽微生物（Halophiles）。 水活度 在天然環(huán)境中，微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水的含量， 一般用在一定的溫度和壓力條件下,溶液的蒸汽壓力與同樣條 件下純水蒸汽壓力之比表示，即： w=Pw/Pow ,式中Pw代表溶液蒸汽壓力, POw代表純水蒸汽壓力。 純水w為1.00,溶液中溶質(zhì)越多, w越小。 微生物一般在w為0.600.99的條件下生長, w過低時(shí), 微生物生長的遲緩期延長,比生長速率和總生長量減少。 微生物不同，其生長的最適w不同。 水活度 （C）氧化還原電勢(redox poyential) 各種微生物對培養(yǎng)基的氧化還原電勢的要求： 好氧微生物：+0.3+0.4V,(在0.1V以上的環(huán)境中均能生長). 厭氧微生物：只能在+0.1V以下生長 兼性厭氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下發(fā)酵 培養(yǎng)基是多氧化還原偶的復(fù)雜電化學(xué)系統(tǒng)，測出的Eh值僅 代表其綜合結(jié)果。 對微生物影響最大的是：分子氧和分子氫的濃度 培養(yǎng)基中常用的還原劑：巰基乙酸、抗壞血酸、硫化氫、 半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等。 氧化還原電位與氧分壓和pH有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響 增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓，或加入 氧化劑，從而增加值； 在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸（0.1%）、硫化氫(0.025%)、半胱氨酸 (0.05%)、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇、庖肉等還原性物質(zhì)可降低值。 培養(yǎng)基中加入氧化還原指示劑刃天青可對氧化還原電位進(jìn)行間接測定 氧化還原電位與氧分壓和pH有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響 3.1.4 根據(jù)培養(yǎng)基的應(yīng)用目的選擇原料及其來源 該培養(yǎng)基的應(yīng)用目的，即： 是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產(chǎn)物？ 是實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵？ 代謝產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)