課件：酶分子修飾 (2).ppt

上節(jié)課主要內(nèi)容回顧,從酶的生產(chǎn)到酶的改性 酶分子修飾 所要解決的問題和修飾的目標(biāo) 酶分子修飾的種類 側(cè)鏈基團(tuán)修飾,酶的改性（enzymic improving）：通過各種方法使酶的催化特性得以改進(jìn)的技術(shù)過程。,酶改性的技術(shù) 酶分子的修飾 酶固定化 酶的非水相催化 酶的定向進(jìn)化 ,酶分子修飾,通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。,4.1 概述,2、酶分子修飾的原因 細(xì)胞外穩(wěn)定性差； 酶活性不夠高； 具有抗原性。,4.1 概述,4、酶分子修飾的目的 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。（70年代末之后） 提高酶的生物活性（酶活力）。 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。 消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）。 產(chǎn)生新的催化能力。,4.4 酶分子的修飾方法,金屬離子置換修飾 大分子結(jié)合修飾 側(cè)鏈基團(tuán)修飾 肽鏈有限水解修飾 氨基酸置換修飾 酶分子的物理修飾,各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑,4. 酶蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）,利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。 主鏈的切斷修飾,1）主鏈的切斷引起酶活性中心的破壞，酶將喪失其活性。 主要用于探測酶活性中心的位置。 2）主鏈切斷后仍可維持酶活性中心的空間構(gòu)象，酶的催化能力保持不變或損失不多，其抗原性等特性發(fā)生改變。 提高某些酶特性特別是藥用酶的使用價值。 3）主鏈切斷有利于酶活性中心的形成，使酶分子顯示其催化功能，使酶活力提高。 酶原酶,主鏈的切斷修飾,胃蛋白酶原,N端失去44個 氨基酸殘基,HCl,pH1.52,自身激活,a、胃蛋白酶原的激活,5. 酶組成單位置換修飾,氨基酸置換修飾：將蛋白酶分子肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸的修飾方法。 核苷酸置換修飾：將核酸類酶核苷酸鏈上的某一個核苷酸換成另一個核苷酸的修飾方法。,（1）酶分子組成單位修飾的作用,通過修飾可以提高酶活力 通過修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 通過修飾可以使酶的專一性發(fā)生改變 通過核苷酸置換修飾可獲得各種人造核酸類酶。,如：酪氨酸-RNA合成酶 反應(yīng)：催化酪氨酸與其對應(yīng)的tRNA反應(yīng)生成酪氨酰-tRNA 置換：將51位的蘇氨酸換為脯氨酸 結(jié)果：酶對ATP的親和性提高近100倍，酶活力提高25倍。,如：枯草桿菌的蛋白酶 反應(yīng)：催化蛋白質(zhì)和多肽水解 置換：活性中心上的絲氨酸換成半胱氨酸 結(jié)果：酶對蛋白質(zhì)和多肽的水解活性消失，出現(xiàn)催化硝基苯酯等底物進(jìn)行水解反應(yīng)的活性。,采用核苷酸置換修飾技術(shù)將保守核苷酸以外的某個或某些核苷酸置換，就可以獲得各種不同的人造核酸類酶。,如：T4-溶菌酶 置換：第3位的異亮氨酸換成半胱氨酸，半胱氨酸可與第97位的半胱氨酸形成二硫鍵。 結(jié)果：酶活力保持不變，但酶對熱的穩(wěn)定性大大提高。,氨基酸置換修飾的方法,化學(xué)修飾法 定點突變技術(shù),（2）定點突變技術(shù)在酶分子修飾中的應(yīng)用,定點突變（site directed mutagenesis ）：指DNA序列中的某一特定位點上進(jìn)行堿基的改變，從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（protein engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。,定點突變技術(shù)用于酶分子修飾的主要過程（P148）,1. 設(shè)計新酶分子結(jié)構(gòu) 設(shè)計新酶的RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，確定需置換的核苷酸或氨基酸及其位置。 2. 確定突變基因堿基序列 酶RNA互補(bǔ)原則DNA序列 酶蛋白遺傳密碼mRNA DNA 3. 獲得突變基因 寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變。 4. 獲得新酶 獲得基因體外重組后導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。,6. 酶分子的物理修飾,通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。 特點在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。 共價鍵與副鍵,酶分子修飾的應(yīng)用,理論研究 醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用 酶的作用機(jī)制研究 親和標(biāo)記法和差示標(biāo)記法 有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用,酶分子的修飾方法,金屬離子置換修飾 大分子結(jié)合修飾 側(cè)鏈基團(tuán)修飾 肽鏈有限水解修飾 氨基酸置換修飾 酶分子的物理修飾,氨基的修飾 羧基的修飾 巰基的修飾 精氨酸胍基的修飾 酪氨酸酚基的修飾 組氨酸咪唑基的修飾 色氨酸吲哚基的修飾 分子內(nèi)交聯(lián)修飾,4.6 酶的定向進(jìn)化,定向進(jìn)化：模擬自然進(jìn)化的過程，進(jìn)行人工隨機(jī)突變，并在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行選擇，使進(jìn)化朝著人們所需方向發(fā)展的技術(shù)過程。,定向進(jìn)化,分子定向進(jìn)化,細(xì)胞定向進(jìn)化,酶分子定向進(jìn)化,蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化,核酸分子定向進(jìn)化,微生物細(xì)胞定向進(jìn)化,植物細(xì)胞定向進(jìn)化,動物細(xì)胞定向進(jìn)化,酶分子的定向進(jìn)化（directed evolution）：模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。,屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。,4.6.1 定向進(jìn)化的特點,適應(yīng)面廣； 目的性強(qiáng)； 效率高。,4.6.2 定向進(jìn)化的原理,以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。 定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。 定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+定向選擇。,4.6.3 酶基因的隨機(jī)突變,1、易錯PCR技術(shù)為代表的無性進(jìn)化 無性突變：向單一酶分子基因內(nèi)隨機(jī)引入突變，制造突變酶庫以便篩選。 易錯PCR：從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件的情況下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，使擴(kuò)增得到的基因出現(xiàn)堿基配對錯誤，從而引起基因突變的技術(shù)過程。,反應(yīng)條件：提高M(jìn)g2+濃度；添加Mn2+；改變四種底物濃度比等。,易錯PCR技術(shù),特點：操作簡便，隨機(jī)突變豐富。 缺點：正突變基因少，需多次PCR。 注意：控制好基因突變頻率。 適用：較小基因的定向進(jìn)化。,2、DNA重排技術(shù)為代表的有性進(jìn)化 DNA重排技術(shù)：又稱DNA改組技術(shù)，有性PCR（sexual PCR）。從正突變基因文庫中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。,DNA改組原理,DNA改組技術(shù),特點：正突變頻率高，進(jìn)化速度快。 注意：需多次進(jìn)行。,3、基因家族之間的同源重組,從自然界中存在的基因家族出發(fā)，利用它們之間的同源順序進(jìn)行DNA改組實現(xiàn)同源重組。,如：Stemmer等從4種微生物中選擇編碼頭孢菌素酶的4個同源基因，對它們進(jìn)行單獨進(jìn)化或同源重組進(jìn)化。結(jié)果對單基因進(jìn)化得到的突變酶中，對頭孢羥羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重組進(jìn)化的方法使抗性比其中兩種微生物來源的天然酶提高270倍，比另外兩種酶提高了540倍。,雜合酶：把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是整個酶分子進(jìn)行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體。,4.6.4 酶分子定向進(jìn)化的選擇策略,定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過選擇特定方向的突變限定了進(jìn)化趨勢，加之控制實驗條件，限定突變種類， 降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進(jìn)化速度。 篩選方法必須靈敏，至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。,1、突變基因文庫的構(gòu)建 定義：將各種不同突變基因與載體重組，再轉(zhuǎn)入適宜的細(xì)胞或包裝成重組噬菌體的技術(shù)過程。 質(zhì)量要求：文庫包容性和文庫完整性 過程： 載體選擇 基因重組 形成基因文庫,質(zhì)粒 噬菌體DNA 黏粒載體 噬菌粒載體,轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo),2、突變基因的篩選 （1）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定 （2）高通量篩選技術(shù) 平板篩選技術(shù) 熒光篩選法 噬菌體表面展示法 酵母細(xì)胞表面展示法,舉例,例1：定向進(jìn)化提高枯草芽孢桿菌脂肪酶的活力 例2：大腸桿菌堿性磷酸酶的體外定向進(jìn)化研究 例3：采用易錯PCR對粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C進(jìn)行定向進(jìn)化,4.6.5 酶的體外定向進(jìn)化應(yīng)用實例,4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157）,在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用 在醫(yī)藥方面的應(yīng)用 在工業(yè)方面的應(yīng)用 在抗體酶研究開發(fā)方面的應(yīng)用 在核酸類酶人工改造方面的應(yīng)用 在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用,4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157）,1、在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用 酶活性中心的研究 酶的空間結(jié)構(gòu)研究 酶的作用機(jī)制研究,4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157）,2、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用 降低或者消除酶的抗原性 增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性（半衰期）,4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157）,3、在工業(yè)方面的應(yīng)用 提高工業(yè)用酶的催化效率 提高工業(yè)用酶的穩(wěn)定性 改變酶的動力學(xué)特性,4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157）,4、在抗體酶研究開發(fā)方面的應(yīng)用 誘導(dǎo)法 修飾法 氨基酸置換修飾 側(cè)鏈基團(tuán)修飾等,4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157）,5、在核酸類酶人工改造方面的應(yīng)用 核苷酸置換修飾 核苷酸殘基修飾,4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157）,6、在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用方面的應(yīng)用 增強(qiáng)酶的疏水性 提高酶活力 提高酶的穩(wěn)定性,小 結(jié),1、什么是酶分子修飾,3、酶分子修飾的基本要求和條件,4、酶分子的修飾方法,5、酶修飾后的性質(zhì)變化,6、酶的定向進(jìn)化,7、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用,2、化學(xué)修飾的原理,思考題,1、試述酶分子修飾的概念和作用。 2、何謂大分子結(jié)合修飾？有何作用？ 3、舉例說明肽鏈有限水解修飾的作用。 4、何謂氨基酸置換修飾？有何作用？ 5、簡述定點突變技術(shù)的主要技術(shù)過程及其在酶分子修飾中的應(yīng)用。 6、酶分子的物理修飾有何特點？ 7、何謂酶定向進(jìn)化？有何特點？ 8、簡述突變基因定向選擇的基本過程。 9、舉例說明酶定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用。,后面內(nèi)容直接刪除就行 資料可以編輯修改使用 資料可以編輯修改使用,主要經(jīng)營：網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計、圖文設(shè)計制作、發(fā)布廣告等 公司秉