生物化學(xué)實驗教案xin11ppt課件

生物化學(xué)實驗,實驗 Folin-Wu法定量測定血糖的含量,一、目的要求 1、掌握FolinWu法測定血糖含量的原理和方法。 2、學(xué)會制備無蛋白血濾液。,二、實驗原理,Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+(Cu2O) Cu2O +酸性鉬酸試劑 藍色鉬化合物 OD420比色 無蛋白血濾液中的葡萄糖和堿性硫酸銅溶液共熱反應(yīng)，Cu2+即被葡萄糖還原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸性鉬酸試劑（Mo6+）還原成低價的藍色鉬化合物鉬藍 。 血濾液中葡萄糖的含量與產(chǎn)生的Cu2O成正比，而Cu2O的量與產(chǎn)生的鉬化合物的量成正比?？捎帽壬ǘ康臏y定。,二、實驗儀器,1、 新鮮兔子血 2、 濾紙 3、 血糖管（25ml） 4、 奧氏吸管（1ml） 5、 錐形瓶（50ml） 6、 漏斗 7、 電爐 8、 水浴鍋 9、7200型可見分光光度計,1、標準葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：稱取1.000g葡萄糖，溶于蒸餾水，稀釋并定容至100ml。 (2)葡萄糖標準液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸餾水定容。 2、10%鎢酸鈉溶液：稱取鎢酸鈉10g，溶于蒸餾水并定容至100毫升。 3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸餾水中加入1ml的濃硫酸。 4、堿性硫酸銅溶液 A液：無水碳酸鈉35g，酒石酸鈉13g及碳酸氫鈉11g溶于蒸餾水，稀釋定容至1000ml. B液：硫酸銅晶體5g，溶于蒸餾水并定容至100ml。 臨用時，A液：B液=15：1混合（體積比），混合液于冰箱中保存（4）。,四、實驗試劑,2、血糖的定量測定： 取25ml的血糖管(見圖1)3支，編號。第一支血糖管中加入1ml蒸餾水（空白管）；第二支血糖管中加1ml標準葡萄糖液；用奧氏吸管吸取無蛋白血濾液1ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的堿性硫酸銅溶液，同時置于沸水浴中8分鐘，取出，在流水中迅速冷卻后各加4ml酸性鉬酸鹽溶液。一分鐘后，用蒸餾水稀釋至25ml，混勻，用7220分光光度計在420波長處比色，以空白管調(diào)節(jié)零點。,按下式計算100ml全血中所含血糖的含量 m=OD1/OD2 C 10 100 式中: m=100ml全血中含血糖毫克數(shù) C=標準液葡萄糖含量（0.1mg/ml） OD1=樣品液光密度值 OD2=標準液光密度值,六、結(jié)果計算：,實驗 肝糖元的提取和鑒定,一、實驗原理 糖原在濃堿中穩(wěn)定，將肝組織先置于濃堿中加熱，使蛋白質(zhì)及其他成分分解而保留肝糖元。再用濃硫酸使糖原脫水生成糖醛衍生物，衍生物和蒽酮作用形成藍色化合物，與同法處理的標準葡萄糖一起比色定量。,二、實驗儀器 1、 新鮮肝臟 2、 100ml容量瓶 3、 7220分光光度計 4、 水浴鍋 5、 試管(ml、2ml、5ml),三、實驗試劑,1、30%NaOH溶液：30gNaOH溶于100ml蒸餾水中 2 、標準葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：準確稱取10mg分析純葡萄糖（預(yù)先在110干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定容至100ml. 3、顯色劑：稱取0.2g蒽酮加入100ml濃硫酸中。此試劑不穩(wěn)定，以臨用時配用為宜，冰箱保存可用45天,四、實驗步驟 1、準確稱取肝組織0.5g，放入盛有1.5ml30%NaOH的試管中，置于沸水浴中加熱20分鐘，取出后冷卻，將管中內(nèi)溶物全部轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中（用蒸餾水多次洗滌試管，一并收入容量瓶）加蒸餾水定容。 2、取干燥試管三支，注明空白管、標準管、測定管，按下表進行操作。加畢，搖勻，置沸水浴中10分鐘，冷卻，以空白管調(diào)節(jié)零點，在620nm波長下比色測定。,五、結(jié)果計算 100g肝組織中所含糖原的克數(shù) =（OD測/OD標）C標2100（1/1000） （100/111） （100/0.5） 注：100/111是此法測的葡萄糖含量換算為糖原含量的常數(shù)，即100g糖原用蒽酮試劑顯色相當于111g葡萄糖用蒽酮試劑所顯得色,實驗五 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的濃度,一、實驗原理 蛋白質(zhì)在堿性溶液中可與CU2+形成紫色化合物，在一定濃度的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與生成的紫色化合物顏色的深淺成正比，可用比色法測定。,二、實驗儀器 1、 試管 2、 吸管 3、 容量瓶 4、 7220分光光度計,三、實驗試劑 1、1mg/ml卵清蛋白液：將1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀釋至1000ml. 2、雙縮脲試劑：將1.75gCuSO4.5H2O溶于約150ml蒸餾水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml濃氨水、300ml冰冷的蒸餾水和200ml飽和氫氧化鈉溶液，搖勻，室溫放置2小時，再加蒸餾水至刻度，搖勻備用。,四、實驗步驟 1、標準曲線的繪制：取7支干燥的試管，按下表加入試劑： 將上述溶液混合后，試管中即有紫紅色出現(xiàn)，在540nm下測的各管的吸光度，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，OD值為縱坐標作出標準曲線。 2、 樣液的測定 取未知濃度的蛋白質(zhì)溶液3.0ml置試管中，加入雙縮脲試劑2.0ml，混勻，測其540nm的吸光度，對照標準曲線求得未知液蛋白質(zhì)濃度。,實驗六 氨基酸的紙層析法,一、原理 以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機溶劑組成。展層時，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強；有機溶劑為流動相，它與濾紙纖維親和力弱。有機溶劑在濾紙上又下向上移動的，稱為上行法；有上向下移動的，稱為下行法。 將樣品在濾紙上確定的原點處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動相移動的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來，形成距原點不等的層析點。 在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動速率（Rf值） Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離 用混合氨基酸做樣品時，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動速率相同或相近，就不能將它們分開，為此，當用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度，以第一次所的層析點為原點，在用另一溶劑展層，從而達到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇ā?本試驗主要介紹的是單向?qū)游龇āＦ渲谢旌习被嵊芯彼?、酪氨酸、苯丙氨酸組成。,二、實驗儀器 1、 新華濾紙 2、 層析缸 3、 細線 4、 點樣管 5、 橡皮筋 6、 電吹風(fēng) 7、 噴霧器,三、實驗試劑 1、 混合氨基酸 2、展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮無水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無水丙酮，貯于棕色瓶中,四、試驗步驟 1、取濾紙條一張，在一端打孔，系一根細線，在另一端3cm處用鉛筆畫一橫線，中間畫一圓點（原點）。 2、取毛細管一支，吸取氨基酸混合液，在原點處點樣，樣點直徑不宜超過5mm,每點一次用吹風(fēng)機吹干，點23次為佳。 3、點樣后將濾紙放入層析缸中展層，注意點樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，展層23小時。 4、取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風(fēng)吹干（或烘箱60）烘干。 5、均勻噴上0.5茚三酮無水丙酮液，注意使溶液不到流，不間斷。 6、用吹風(fēng)機烘干，觀察層析點，確定其幾何中心。 7、量取數(shù)值，計算各自的Rf值，與表中標準氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類。,實驗七 醋酸纖維薄膜電泳法分離牛血清蛋白,一、原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。當PHPI時，蛋白質(zhì)為負離子，在電場中向陽極移動；當PHPI時，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，在同一PH值時，因所帶電荷不同，而在電場中的移動速度也不相同，故可用電泳法將其分離。 本試驗以牛血清為材料，醋酸纖維薄膜為支持物，通過點樣、電泳、染色、脫色從而得到血清中蛋白質(zhì)的分離圖譜，再進行觀察和定量分析。,二、實驗儀器 1、 牛血清 2、 醋酸纖維薄膜 3、 鑷子 4、 電泳儀 5、 電泳槽 6、 載玻片,三、實驗試劑 1、巴比妥巴比妥鈉緩沖液（離子強度，PH8.6）：稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g，溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。用pH計較正后使用。 2、 染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸餾水40ml混勻即可。 3、 漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml混勻即可。,四、試驗步驟 1、準備：用鑷子取薄膜一條，浸入緩沖液中，完全浸透后（大約3-5分鐘），用鑷子取出，將無光澤的一面向上，平放在干凈濾紙上，將濾紙對折，吸取多余的緩沖液。 2、點樣：取載玻片一塊，用點樣管將血清均勻的涂在載玻片的一端面上，在薄膜一端1/3處點樣。 3、電泳：將薄膜平貼于放在電泳槽上并已浸透緩沖液的濾紙上，無光澤面要向下放置，點樣端放在陰極，進行電泳。電泳條件：電壓90-110V，電流0.4-0.6A,通電60分鐘。 4、 染色：電泳完畢，將薄膜浸入染色液中5-10分鐘，進行染色。 5、漂洗：染色完畢，將薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景無色，在浸入蒸餾水中。 6、圖譜觀察：觀察圖譜，將各種血清蛋白質(zhì)按實際比例大小繪于實驗報告紙上。,一、原理 聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳是根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子的大小，形狀的不同，在電場的作用下，產(chǎn)生不同的速度而分離的方法。 它具有分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)、濃縮效應(yīng)三重作用。 在這三重效應(yīng)的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白質(zhì)分離開來。,實驗八 聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法分離牛血清蛋白,二、實驗儀器 電泳儀 電泳槽 注射器 長針頭 吸管 培養(yǎng)皿,三、實驗試劑,三羥甲基氨基甲烷（簡稱Tris） 貯備液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各貯備液，然后冷藏于4條件下，以防變質(zhì)。 染色液： 0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用靈敏度高5倍考馬斯亮藍R250溶液染色。 脫色液：7%醋酸溶液。 電極緩沖液（pH8.3甘氨酸-Tris緩沖液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml. 示蹤劑：0.01%溴酚藍溶液。,四、實驗步驟,1.制膠：取一支長10cm左右的玻璃管，在一端套上乳膠管和短玻棒。 1）7%聚丙烯酰胺凝膠（PH8.9，分離膠）： 將試劑按A:C:H2O:E=1：2：1：4比例混合于一燒杯中，用滴管將分離膠加入玻璃管至8cm高度，表面再加少量水覆蓋，在日光燈下聚合20分鐘左右，當有界面出現(xiàn)時，表明已經(jīng)聚合，吸取分離膠表面的水分。,2）2.5%聚丙烯酰胺凝膠（pH6.7，分離膠）： 將試劑按B:D:F:E=1：2：1：4比例混合于燒杯中，迅速將其用滴管加到分離膠上面。 至玻璃管9厘米處（即加入1厘米高），在小心地加入一層薄水。 然后膠管移至日光燈下放置20分鐘左右，待第二次出現(xiàn)界面，表示聚合完成，除去表面水分。,2.安裝膠管 把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔時用力不要過猛，以防使膠條受損），將膠管安裝在電泳儀上。 注意垂直，并要緊密，防止緩沖液從上槽漏下。 先向各膠管中加滿電極緩沖液，不要有氣泡留存，在向下槽注入緩沖液，然后將膠管下降至下槽緩沖液內(nèi)。 3.加樣 1ml新鮮血清。用40%蔗糖溶液稀釋10倍，加1ml0.1%溴酚藍示蹤劑混勻。 用微量注射器或移液槍向膠管內(nèi)加5-10ul樣品液，注意微量注射器或移液槍頭要插入膠管內(nèi)加液。,4.電泳 上槽連接負極，下槽連接正極，然后通電，先每管電流3mA電泳，當示蹤劑進入分離膠時，電流增至每管5mA。 當示蹤劑移至膠管下端1cm處時，關(guān)閉電源，取出膠管。電泳大約2-3小時。 5.剝膠 取一只帶長針頭的注射器，灌滿水，將針頭從濃縮膠的一端小心的管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動膠管，并同時推動注射器，在針頭向前推動時，注入蒸餾水，使膠條隨水的壓力及潤滑作用從玻璃管中脫離。,6.染色 將剝出的膠條于氨基黑10染色液或染色靈敏度高倍的考馬斯亮藍溶液中染色10分鐘 7.脫色 將膠條自染色液中取出后，用水沖去表面的染料，置于7%醋酸溶液中浸洗脫色，經(jīng)常換新溶液，直至背景幾乎無色為止，約需2-3天的時間 8.觀察繪圖 將脫色膠條取出放于濾紙上，觀察分離色帶，將結(jié)果繪于實驗報告紙上。,實驗九 胰蛋白酶活力測定,一、原理 福林酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍色化合物（鎢藍和鉬藍）。 蛋白質(zhì)中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸與福林酚試劑反應(yīng)，生成藍色化合物，在一定的范圍內(nèi)，藍色化合物顏色的深淺與酶活力的大小成正比。,二、實驗儀器 試管 7220分光光度計 恒溫水浴鍋,三、實驗試劑 福林試劑B：見福林(Folin)-酚試劑法測定蛋白質(zhì)的濃度部分 0.55mol/L碳酸鈉溶液：58.3g無水碳酸鈉溶于蒸餾水，稀釋并定容至1000ml 10%三氯乙酸溶液 0. 2mol/L磷酸緩沖液(pH7.5)： 0.5% 酪素溶液：稱取0.5g酪素，以0.5mol/L氫氧化鈉1ml濕潤，再加少量0. 2mol/L磷酸緩沖液稀釋。在水浴中煮沸溶解，冷卻，稀釋并容至100ml，冷藏在冰箱里。,四、實驗步驟,標準曲線的制作： 精確稱取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2mol/L鹽酸溶解，定容至100ml，分別配成0-100ug/ml不同濃度溶液，不同濃度各取酪氨酸液1ml，加0.5%酪素2ml，于37水浴中反應(yīng)15分鐘，然后加入10%三氯乙酸3ml，離心或過濾除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸鈉5ml，再加入福林試劑1ml，于37 水浴中顯色15分鐘，測OD680。 以光密度為縱坐標，酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標繪制標準曲線。,樣品測定：取干燥的試管2支，按下表加入試劑,五、結(jié)果計算,酶活力：在37下每分鐘水解酪素產(chǎn)生lug酪氨酸為一個活力單位。 樣品中含酶活力單位=A/15 F A樣品測定光密度查曲線得相當酪氨酸ug數(shù) F酶液稀釋倍數(shù),實驗十、酵母RNA的提取及鑒定,一、原理 酵母核酸中RNA含量較多，DNA含量則少于2%。 RNA可溶于堿性溶液，當堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。,二、實驗儀器 離心機 水浴鍋 電爐 燒杯 量筒,三、實驗試劑,干酵母粉 0.2%氫氧化鈉溶液：2g氫氧化鈉溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。 乙酸 95%乙醇 無水乙醚 10%硫酸 氨水 5%硝酸銀溶液：5g硝酸銀溶于蒸餾水并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中。 苔黑酚-三氯化鐵溶液：將100mg苔黑酚溶于100ml濃鹽酸中，再加入100mgFeCl3.6H2O。臨用時配制。,四、實驗步驟,1.RNA的提取：稱取2g干酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%氫氧化鈉溶液20ml，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。然后加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（石蕊試紙），離心10-15分鐘（4000r.p.m）。 取上清液，加入2倍體積的95%乙醇，邊加邊攪，加畢，靜止，待完全沉淀，過濾。 濾渣先用95%乙醇洗2次，每次約5毫升，再用無水乙醚洗2次，每次也約5ml。 洗滌時可小心地用玻璃棒攪動沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可鑒定。,2.鑒定：取上述RNA約0.5g，加10%硫酸5ml,加熱至沸12分鐘，將RNA水解。 取水解液0.5ml，加入苔黑酚-三氯化鐵溶液1ml，加熱至沸1分鐘，觀察顏色變 化。 水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸銀溶液1ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物。,實驗十一 DNA的定量測定-二苯胺法,一、原理 DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中變成-羥基-a-酮基戊糖，與二苯胺試劑作用生成藍色化合物，在一定波長范圍內(nèi)，化合物藍色的深淺與DNA的含量成比例關(guān)系，可用比色法測定。,二、實驗儀器 試管 移液管 7220分光光度計,三、實驗試劑,1、DNA標準液（100ug/ml）：稱取10mgDNA鈉鹽溶于5mol/l氫氧化鈉溶液并稀釋至100ml。 2、二苯胺試劑： A液：稱取純二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加濃硫酸1.5ml。貯于棕色瓶中。 B液：稱取1.6ml乙醛溶于100ml蒸餾水中，臨用時配制 臨用時，將20mlA液和0.1mlB液混合即可,四、試驗步驟 1.標準曲線的繪制 取干燥的試管6支，編號，按下表加入試劑：,加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長下測吸光度，以吸光度對DNA濃度作標準曲線。,2.樣品測定 吸取DNA樣液1ml，加入二苯胺溶液2.0ml, 加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長下測吸光度，根據(jù)所測得的吸光度對照標準曲線求得DNA的質(zhì)量。 五、結(jié)果計算 按下式計算樣品中DNA百分含量： DNA%=樣液中測的DNA量/樣液中所含樣品量*100%,實驗十二 維生素C的定量測定（2，6-二氯靛酚滴定法）,一、原理 維生素c又稱為抗壞血酸，其還原型能還原染料2，6-二氯靛酚鈉鹽，本身則氧化成脫氫抗壞血酸。 在酸性溶液中，2，6-二氯靛酚成紅色，被還原后變?yōu)闊o色。 因此可用2，6-二氯靛酚滴定樣品中含有的維生素C，當樣品中的維生素C被完全還原后，在滴加過量的2，6-二氯靛酚，溶液變?yōu)榈t色，即為終點。 如無其他雜質(zhì)干擾，則樣品液所還原的2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含有維生素C的量成正比。,二、實驗儀器 新鮮水果 吸管 容量瓶 滴定裝置 錐形瓶 研缽 漏斗,三、實驗試劑 1、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸餾水。 2、1%草酸溶液：草酸1g，溶于100ml蒸餾水。 3、標準維生素C液：準確稱取10.0mg維生素C，溶于1%草酸溶液，并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中，冷藏，最好臨用時配制。此溶