《昆蟲病毒的利用》PPT課件.ppt

昆蟲病毒的利用,主講人：龔靜（2004級碩士研究生）,主要內(nèi)容,1 前言 2 昆蟲病毒的類群 3 重要昆蟲病毒概述 4 昆蟲病毒的生產(chǎn) 5 昆蟲病毒在害蟲防治上的應(yīng)用,1. 前言,昆蟲病毒是引起昆蟲致病和死亡的重要病原體。最早關(guān)于昆蟲病毒的記載是中國，在1149年出版的農(nóng)書中，就記載有家蠶的“高節(jié)”“腳腫”病，這就是現(xiàn)在所稱的核型多角體病毒病。,2 昆蟲病毒的類群,病毒virus：一類形態(tài)最小，結(jié)構(gòu)最簡單的微生物。由單一的核酸(RNA或DNA)組成中心核、核外包裹一層外殼蛋白組成。 病毒病viral disease：由病毒病原體引起的疾病。,2.1 昆蟲病毒的基本特征,昆蟲病毒的一般構(gòu)造： - 昆蟲病毒是一類沒有細(xì)胞構(gòu)造的生物體 - 主要組成是核酸和蛋白質(zhì)。 - 病毒個體稱為病毒粒子(virion)，由兩部分構(gòu)成：內(nèi)面是核心（core），成分為核酸；外層是衣殼(capsid)，成分是蛋白質(zhì)。 有些衣殼外包被有囊膜。成分為脂類。 核酸的功能是攜帶遺傳信息，決定病毒的遺傳變異性和傳染性。 蛋白質(zhì)的功能是保護(hù)核酸，并決定病毒的抗原性。,不同種類病毒的結(jié)構(gòu),2.1 昆蟲病毒的基本特征,昆蟲病毒的侵染活動： 在寄主外存在時沒有代謝、生長和繁殖，只保留在適宜條件下侵染寄主的潛在能力。 在不適宜的環(huán)境下活性較易喪失。 對溫度很敏感，在55 60時，病毒懸液幾分鐘內(nèi)就會變性。 X-射線、-射線和紫外線照射能使病毒變性失活。 有囊膜的病毒容易被脂肪溶劑破壞。一般常用甲醛等消毒劑來消毒被病毒污染的器皿和空氣。,2.2 昆蟲病毒的分類,2.2.1分類依據(jù)： 形態(tài)學(xué)特征 囊膜的有無；病毒粒子的形狀、大小；亞顯微結(jié)構(gòu)等 生物化學(xué)和生物物理學(xué)特征 核酸類型、核酸特性、蛋白質(zhì)構(gòu)成以及隔成分的含量、 分子量、浮力密度和沉降系數(shù)等 生物學(xué)特征 病毒入侵生物體的復(fù)制過程、寄主范圍和傳遞方式等,2.2 昆蟲病毒的分類,2.2.2昆蟲病毒的類群： 根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV） 1981年通過的分類方案，所有已知病毒分為54個科和群，此外還包括5個建議的或可能的科和群。 目前已經(jīng)明確分類地位的昆蟲病毒有11科。,2.3 昆蟲病毒的診斷鑒定,一般的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方法： 根據(jù)染病蟲體的癥狀進(jìn)行診斷。凡是產(chǎn)生多角體的病毒類型，用一般光學(xué)顯微鏡觀察而明確病毒的存在，并可采用某些染色方法來鑒別是哪一類具包涵體的病毒。 生物鑒定方法： 通過感染試驗方法鑒別病毒的存在，比如接種后能引起健蟲發(fā)生同樣疾病。,2.3 昆蟲病毒的診斷鑒定,電子顯微鏡觀察 通常包括超薄切片技術(shù)、負(fù)染色技術(shù)和投影技術(shù)等。 血清學(xué)方法 該法可確定各個分離株的親緣關(guān)系，鑒別用一般方法難以區(qū)分的病毒。 生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究鑒定,3 重要昆蟲病毒的概述,到1986年前為止： 國內(nèi)外已從約1100種昆蟲、螨類中分出約1690種病毒 我國已從約7目26屬190種昆蟲中分離出234株病毒,3 重要昆蟲病毒的概述,已知昆蟲病毒的寄主有鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、半翅目、同翅目、脈翅目、革翅目、毛翅目、蜉蝣目、蜻蜓目等，尤以鱗翅目為主要寄主。 昆蟲病毒中的包涵體病約占90以上，其中鱗翅目寄主約為80，雙翅目10。在無包涵體病毒中，鱗翅目寄主占33，雙翅目23，鞘翅目18，膜翅目2.5,3 重要昆蟲病毒的概述,目前已知至少有20余類的昆蟲病毒，但研究歷史最長、防治應(yīng)用最廣的是桿狀病毒科中的核型多角體病毒和顆粒體病毒以及呼腸孤病毒科中的質(zhì)型多角體病毒。,3.1 核型多角體病毒(NPV),核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis viruse,簡稱NPV)是研究得最早和最為詳細(xì)的一類昆蟲病毒。 到1986年為止，國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)464株，中國約124株，其中78株為首次發(fā)現(xiàn)。 在分類上為桿狀病毒屬（Baculovirus）的A亞組。,3.1 核型多角體病毒(NPV),一般形態(tài)特征： - 具有較大的包涵體，稱為多角體(polyhedra，簡稱IB或PIB)，在被感染的細(xì)胞核內(nèi)形成。 - 多角體大小常因寄主昆蟲種類的不同而不同，甚至在統(tǒng)一寄主細(xì)胞內(nèi)，多角體的形狀大小也有區(qū)別。常見的形狀有三角形、四角形、五角形、立方體、不規(guī)則形等。,NPV病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu),病毒粒子桿狀，所以又稱為病毒桿狀體。 病毒粒子由外到內(nèi)： 囊膜（內(nèi)膜）一層脂質(zhì)膜 衣殼（內(nèi)膜）主要成分是蛋白質(zhì) 髓核由DNA組成，呈螺旋狀 后兩者加在一起成為核衣殼。 在NPV中，通常一個囊膜內(nèi)由多個排列成束的核衣 殼，稱為病毒束。 一個品系的NPV，可能每個囊膜內(nèi)均只有一個核衣殼，也由可能每個囊膜內(nèi)由1到多個核衣殼而成為“病毒束”，前者稱為單粒包埋型病毒，后者稱為多粒包埋型病毒。,NPV的理化性狀,不溶于水及多種有機(jī)溶劑如乙醇、乙醚、三氯甲烷、苯、丙酮等 強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液處理，能使多角體蛋白質(zhì)溶解。,NPV的理化性狀,病毒粒子外有包涵體的保護(hù)，可在自然條件下存活多年仍不失效。對低溫有較高的忍受力。 如家蠶NPV在135150條件下反復(fù)凍結(jié)融解5次，其感染力不變。對高溫的抵抗力較差，如粉紋夜蛾NPV的失活溫度為828810min，棉鈴蟲NPV的失活溫度為758010min，粘蟲的NPV在100經(jīng)10min失活。,NPV對昆蟲的侵染,感病特征： 以鱗翅目為例： 感病初期無明顯異常變化 行動遲緩食欲減退，體色變淡或呈油光 病蟲常爬向寄主植物高處，死前體軀變軟 以腹足緊附枝葉倒掛而死 皮膚則脆弱易裂，破后流出乳白色或褐色的 濃稠液體，內(nèi)含大量新形成的核多角體。,NPV的感染途徑,卵期被病毒污染的蟲卵在幼蟲孵化時因吞食卵殼而感染。 舞毒蛾剛孵化出的幼蟲常因食人染有LdNPV的卵殼而致死。病死的初孵幼蟲又為后期幼蟲提供接種源。在幼蟲期因LdNPV引起的死亡率常出現(xiàn)兩個高潮，一是在孵化后12周，一是在末齡幼蟲期。,NPV的感染途徑,幼蟲被感染后直至出現(xiàn)癥狀和病征的這段潛伏期受多種因素的影響。 接種量少則潛伏期長。 幼蟲齡期越后易感性一般較小，潛伏期也延長。 溫度顯著影響潛伏期長短，如家蠶在正常室溫下57天就出現(xiàn)病征，16 17時15天內(nèi)不出現(xiàn)病征。 較高的相對濕度也能誘發(fā)某些昆蟲發(fā)生病毒病 。,NPV的選擇性與專化性,桿狀病毒曾以選擇性和?；愿叨Q，但試驗證明一種昆蟲的桿狀病毒能感染其他昆蟲的事例并不少見。 家蠶NPV能侵染柞蠶等11種昆蟲。歐洲云杉卷葉蛾(Choristoneura murinana)的NPV能侵染云杉卷葉蛾(Cfuniiferana)、蘋果囊蛾、李食心蟲、歐洲松梢卷葉蛾等。紅棕灰夜蛾(Sarcopolia illoba)NPV能侵染銀紋夜蛾、黃地老虎、粘蟲等12種夜蛾科害蟲。,NPV的交叉感染性,一種昆蟲也可合并感染兩類不同的病毒，如黃地老虎、菜粉蝶、粘蟲、粉紋夜蛾、云杉卷葉蛾等可合并感染核型多角體病毒和顆粒體病毒。粘蟲合并感染NPV和GV時，GV能增強(qiáng)NPV的感染，有協(xié)同增效作用。有些合并感染則有干擾作用，如云杉卷葉蛾先感染的病毒妨礙后感染病毒的發(fā)展。,3.2 顆粒體病毒(GV),顆粒體病毒（granulosis virus，簡稱GV）在分類上屬桿狀病毒科B亞組，是有包涵體的昆蟲病毒。 目前為止國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)GV約130株，中國發(fā)現(xiàn)約42株，其中26株為首次發(fā)現(xiàn)。,GV的一般形態(tài)特征,包涵體稱顆粒體(granule) 或莢膜(capsule)。 先在被感染細(xì)胞的核內(nèi)形成，但當(dāng)核膜破裂后可溢出到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。 包涵體很小。在電子顯微鏡下觀察，顆粒體的形狀有卵形、橢圓形、長卵形等，通常直徑為0.10.3m，長0.31.0m。每個包涵體內(nèi)一般只有一個病毒粒子。有時也出現(xiàn)不正常的形狀。,左圖：霜天蛾GV的形態(tài) 右圖：小菜蛾GV經(jīng)堿處理后 的病毒粒子,GV的理化性狀,不溶于水和一般的有機(jī)溶劑如乙醚、乙醇、丙酮、二甲苯等。 遇強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，包涵體能迅速溶解，并可使病毒粒子變性而失去侵染力。,GV的理化性狀,可在室溫下保存5年以上而不失侵染力。 高溫可使其失活。 冰凍無多大危害。較低的溫度有可能延長貯存的時期。 紫外線或其他輻射線能使完整的病毒失活。 用稀堿處理后可獲得完整和具侵染性的病毒粒子。,GV對昆蟲的侵染,感病特征： 感染初期無明顯病征 之后出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍和停止取食 隨后蟲體顏色發(fā)生改變，血液漸變?nèi)榘?感病蟲體可能膨大或收縮 已死幼蟲體壁脆弱，破后流出大量顆粒體。 染病幼蟲可存活較長時間。 病死蟲體有時用腹足倒掛枝葉上，呈“”形。,GV的感病特征,染病幼蟲常于幼蟲期即死，有時也可活至蛹期或成蟲期。從染病到死亡所經(jīng)時間因蟲而異。一般45天，可長至34天，如粘蟲。幼蟲齡期、侵染劑量、溫度等因素也能影響這段時期的長短。,GV的感染途徑,通過口服進(jìn)入易感蟲體，顆粒體在中腸中溶解，游離的病毒粒子通過腸道柱形細(xì)胞的微絨毛而侵入，在這些細(xì)胞核中增殖，新形成的顆粒體病毒釋放于血淋巴中而導(dǎo)致對其他組織的繼發(fā)感染。 蟲體外傷和寄生天敵產(chǎn)卵可引起GV對皮下感染，也可經(jīng)卵垂直傳播。,GV的?；?顆粒體病毒的?；暂^強(qiáng)，交叉感染的情況甚為少見，一般認(rèn)為顆粒體病毒是包涵體病毒含DNA的各類中專化性最強(qiáng)的一類。 以往尚無顆粒體病毒能在植物或其他動物細(xì)胞中增殖的報道。近年我國用小菜蛾細(xì)胞系BCIRL-Px2-HNU3復(fù)制小菜粉蝶GV和用家蠶細(xì)胞系Bm-21E-HNU5復(fù)制小菜蛾GV成功。,GV的交叉感染現(xiàn)象,鱗翅目幼蟲可合并感染NPV和GV兩種病毒。如黃地老虎、菜粉蝶、粘蟲等可同時感染顆粒體病毒和NPV。粘蟲的六齡幼蟲如單感染NPV，死亡率3.4，單感染顆粒體病毒，死亡率20%，如二種合并感染，則死亡率為80，死體為NPV病征，體內(nèi)主要是核型多角體，也有些同時存在顆粒體。,3.3 質(zhì)型多角體病毒(CPV),質(zhì)多角體病毒（cytoplasmic polyhedrosis virus，簡稱CPV）的發(fā)現(xiàn)比NPV和GV都要遲。日本蠶病學(xué)家石森直人早于1934年就觀察到家蠶的中腸上皮細(xì)胞內(nèi)存在有多角體，但當(dāng)時并未確定是由一種新型病毒引起的。 CPV可感染鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、脈翅目5目昆蟲，但主要見于鱗翅目和雙翅目。到1986年前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)CPV228株，代表種為家蠶CPV。,CPV作為殺蟲劑應(yīng)用的不多，主要原因是只侵染中腸上皮細(xì)胞，在自然界中以慢性感染的地方病出現(xiàn)。如廣泛用于生物制劑尚須進(jìn)一步進(jìn)行安全試驗研究。 當(dāng)前CPV用于害蟲防治實(shí)踐的有日本赤松毛蟲(Dendrolimus spectabilis) CPV、。,CPV的一般形態(tài)特征,其包涵體和NPV相似，也是多角體，但只在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成。質(zhì)型多角體呈六角形、四角形、球形、橢圓形等。 質(zhì)型多角體的直徑為0.5m25m， 1個多角體可包埋10010 000個病毒粒子。病毒粒子為球形二十面體，直徑為30nm60nm，有內(nèi)、外兩個二十面殼，每個殼有12個小單位構(gòu)造。,1 BmCPV的包涵體形態(tài)，右下為該包涵體的模式圖 2 家蠶質(zhì)型CPV的包涵體形態(tài)，右上角為此包涵體的模式圖 3 揚(yáng)雪毒蛾CPV的多角體掃描電鏡圖像 4 舞毒蛾CPV包涵體的掃描電鏡圖像,CPV的理化性狀,不溶于水，但在水中經(jīng)較長時間可被蝕刻，而從表面失去粒子。 在堿液中的溶解度比NPV多角體的溶解度為小，如以稀Na2CO3液或其他稀堿液處理，能失去表面病毒粒子，剩下不溶解的多角體，呈多孔的海綿狀。 在堿液中很快被破壞，在從多角體中分離提純時須加注意。,CPV對昆蟲的侵染,感病特征： 早期食欲不振、體軀變小，有時蟲體比例不當(dāng)，頭部顯得大。中腸中多角體的大量增殖使體色改變?yōu)辄S色或淡白色等。中腸細(xì)胞液化后，多角體可被嘔出或由糞便排出。,CPV的感染過程,質(zhì)型多角體病毒被易感昆蟲口服后或?qū)⒂坞x的病毒粒子注射入蟲體血腔均可引起感染。 病毒進(jìn)入蟲體消化道后為堿性消化液溶解而釋放出粒子，繼而侵入中腸上皮細(xì)胞，在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增殖，也可傳染至前后腸細(xì)胞。形成多角體后，有半數(shù)以上的病毒粒子不被包埋而游離，釋放到細(xì)胞間隙，再次感染健康細(xì)胞。最后細(xì)胞解體，多角體脫落在中腸腔。一般經(jīng)720天死亡。,CPV的專化性,通常認(rèn)為質(zhì)型多角體病毒只感染中腸上皮細(xì)胞。一般認(rèn)為其寄主專化的程度似較多數(shù)含DNA病毒者為低。往往能超科感染，從不同寄主所獲分離毒株也有同種的可能。,4 昆蟲病毒的生產(chǎn),病毒為專性寄生病原，至今尚未研究出能在人工培養(yǎng)基上生長，只能在活細(xì)胞中增殖。因此，目前國內(nèi)外應(yīng)用于害蟲防治的昆蟲病毒制劑主要是通過活蟲體增殖和細(xì)胞培養(yǎng)法繁殖。,4.1 在昆蟲活體中大量增殖昆蟲病毒,3種途徑： 直接在自然種群中繁殖 從野外采回大量活蟲接種繁殖 在室內(nèi)條件下飼育大量害蟲接種繁殖 可采用自然飼料或人工飼料。近年來，各種類型的昆蟲病毒包括NPV、CPV、GV和昆蟲痘病毒等通過人工飼料飼育昆蟲而增殖均獲得較好的成效。,4.2 在細(xì)胞系中大量增殖昆蟲病毒,用組織培養(yǎng)增殖的病毒在致病性、專化性及其他特性方面有無變異，尚待進(jìn)一步研究。同時，因組織培養(yǎng)法要求條件較嚴(yán)格，大量增殖病毒還存在不少問題，目前尚未達(dá)到實(shí)用階段。,4.3 昆蟲病毒殺蟲劑的生產(chǎn)實(shí)例,1 核多角體病毒殺蟲劑 2 顆粒體病毒殺蟲劑,4.3.1 核多角體病毒殺蟲劑,目前，核型多角體病毒是應(yīng)用最廣泛的昆蟲病毒。在中國已進(jìn)入大田試驗的生產(chǎn)示范的核多角體病毒殺蟲劑有：棉鈴蟲NPV、斜紋夜蛾NPV、油桐尺蠖NPV、茶黃毒蛾NPV、舞毒蛾NPV、美國白蛾NPV、楊尺蠖NPV、甘藍(lán)夜蛾NPV等。 現(xiàn)以斜紋夜蛾NPV為例，介紹NPV殺蟲劑的生產(chǎn)工藝及流程。,斜紋夜蛾NPV殺蟲劑的生產(chǎn),斜紋夜蛾屬鱗翅目夜蛾科。分布很廣，遍及全國，危害植物達(dá)99科290種以上，在大田作物中，主要危害棉花、大豆、花生、芝麻、煙草、甘薯、甜菜、玉米、高粱、水稻等，在蔬菜中，主要危害甘藍(lán)、白菜等十字花科蔬菜和水生蔬菜，也危害芋頭，莧菜、馬鈴薯、番茄、辣椒、瓜類、豆類等。,斜紋夜蛾NPV的生產(chǎn)工藝,1 健康斜紋夜蛾幼蟲的人工飼養(yǎng)和管理 人工飼料的成分：黃豆粉100g，山梨酸1.6g，麩皮100g，泥泊金1.6g，酵母粉40g，水1000ml，瓊脂12g，L-抗壞血酸4g 卵管理：在幼蟲孵化前一天，用5福爾馬林溶液將卵塊浸泡15分鐘，無菌水漂洗3次，滅菌紙上晾干，移入盛有人工飼料的塑料盒里，放置25度條件下孵育,1 健康斜紋夜蛾幼蟲的人工飼養(yǎng)和管理,幼蟲管理： 根據(jù)以幼蟲的生活習(xí)性盒飼養(yǎng)密度的要求，把幼蟲分為兩階段進(jìn)行飼養(yǎng)。14齡幼蟲飼養(yǎng)密度可為300粒500粒/盒；蟲子養(yǎng)到4齡后，飼養(yǎng)密度要適當(dāng)調(diào)小。由于46齡幼蟲蛻皮會吐水，造成容器濕度過大，影響生長發(fā)育。所以相對濕度也應(yīng)適度調(diào)低。,1 健康斜紋夜蛾幼蟲的人工飼養(yǎng)和管理,蛹的管理： 將老熟幼蟲放入自制的沙營造蛹室（在已消毒的有紗蓋的木盒里，放入10cm高的已高溫消毒的沙子），待蛹體變黑后，挑取個體大，富有光澤，有活力的蛹，放入產(chǎn)卵箱羽化。 成蟲管理： 將蛹放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，移入紙制養(yǎng)蟲籠內(nèi)，每籠放10對蛹，成蟲交配產(chǎn)卵后收剪卵塊。,斜紋夜蛾NPV的生產(chǎn)工藝,2 幼蟲感染和回收 將飼養(yǎng)至4齡的幼蟲，按一定的濃度進(jìn)行涂毒感染，飼養(yǎng)24小時后換無毒飼料。從感染后的第5天開始收集病死蟲。收集的死蟲即使處理或放冰箱冷藏。,斜紋夜蛾NPV的生產(chǎn)工藝,3 病毒提取干燥 將病蟲尸以1：10自來水混合，倒入電動勻漿機(jī)研磨過濾，濾液經(jīng)差速離心法，離心34次，收集沉淀，漿沉淀按1：1加入填充劑存放20下保存。取凍結(jié)的沉淀物機(jī)械粉碎，便可獲多角體干粉。經(jīng)顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)確定含量，存放于4冰箱備用。 4 產(chǎn)品的質(zhì)量檢測與藥效 含量毒力測定產(chǎn)品衛(wèi)生性檢測產(chǎn)品安全性檢測,4.3.2 顆粒體病毒殺蟲劑,我國在基礎(chǔ)和應(yīng)用方面研究較詳細(xì)的顆粒體病毒有菜粉蝶GV，小菜蛾GV，黃地老虎GV，茶小卷葉蛾GV等，其中菜粉蝶GV列入國家“七五”攻關(guān)項目進(jìn)行研究，并完成了中試生產(chǎn)。,菜粉蝶GV殺蟲劑的生產(chǎn),菜粉蝶為世界性重要害蟲。其幼蟲又名菜青蟲，是我國分布最普遍，為害最嚴(yán)重，經(jīng)常成災(zāi)的害蟲，幼蟲偏嗜十字花科蔬菜，幼蟲將葉片咬成孔洞和缺刻，嚴(yán)重發(fā)生時可將葉片全部吃光。,菜粉蝶GV的生產(chǎn)工藝,1 人工飼料飼養(yǎng)菜青蟲 將菜粉蝶卵于人工模擬產(chǎn)卵卡上孵化后，人工飼料飼養(yǎng)至3齡，大部分用來增殖病毒，小部分繼續(xù)飼養(yǎng)傳代，每代2128天。 2 感染回收 將飼養(yǎng)的3齡菜青蟲防于特制的塑料籃子中饑餓34小時，將病毒用電動噴霧器均勻噴在菜葉上，喂食菜青蟲。一般經(jīng)過67天后，菜青蟲開始感病死亡，及時收集病蟲。,菜粉蝶GV的生產(chǎn)工藝,3 顆粒體的提取 經(jīng)感染的病蟲用0.7NaCl浸泡，投入電動勻漿機(jī)。將蟲漿加入510倍的鹽水，電動攪拌機(jī)攪拌，用3080目尼龍過濾3次。濾液2000r/min離心30min，收集沉淀。 5 拌和、分裝 將標(biāo)定含量的病毒原粉中加入展著劑，粘著劑，保護(hù)劑等拌和均勻，定量分裝。 6 產(chǎn)品質(zhì)量檢驗,5 昆蟲病毒在害蟲防治上的應(yīng)用,5.1 應(yīng)用昆蟲病毒防治害蟲的現(xiàn)狀 較早應(yīng)用于森林害蟲膜翅目葉蜂類的防治，如歐洲云杉葉蜂、歐洲松葉蜂、斯氏松葉蜂等，在林區(qū)應(yīng)用NPV等可獲得較為持久的防治效果。 在鱗翅目森林害蟲中，利用病毒防治有效的實(shí)例也不少。如舞毒蛾，天幕毛蟲、松毒蛾、松帶蛾等林木害蟲。 目前大約已有50余種昆蟲病毒進(jìn)行過大田防治試驗。,我國約有20種昆蟲病毒進(jìn)行過或正在進(jìn)行大田試驗。其中研究較多應(yīng)用較廣的如棉鈴蟲NPV，用該種病毒防治棉鈴蟲，每667m2用感染病毒的老齡死蟲230頭(核型多角體數(shù)約為0.156l011)對水噴霧，在棉花生長期發(fā)生害蟲時每隔45天噴1次，共噴9次，棉花產(chǎn)量比對照區(qū)顯著增產(chǎn)。 美國應(yīng)用棉鈴蟲NPV的制劑防治棉花、玉米、高梁、煙草、番茄等作物上的棉鈴蟲和煙草夜蛾等害蟲的效果一般相當(dāng)于常用化學(xué)農(nóng)藥。,加拿大研究菜青蟲的黃絨繭蜂能在寄主種群中傳播GV。 美國研究于甘藍(lán)幼苗移植時以粉紋夜蛾NPV污染幼苗，能在整個生長季節(jié)維持較高病毒濃度并向周圍傳開，84天后未處理區(qū)植株上幼蟲死亡率竟高達(dá)89。 椰犀角金龜子(Oryctes rhinoceros)種群密度不高時(25頭hm2)散布獨(dú)角仙桿狀病毒(C亞組)，活動的成蟲傳播病毒每月可達(dá)3km，5個月后該蟲種群中病毒病發(fā)展到流行水平。,利用病毒防治害蟲一方面可以起到微生物殺蟲劑的短期防治作用，另一方面使用后有可能使病毒長期存在于農(nóng)林生態(tài)系中，作為一類被引入的生態(tài)因子而起調(diào)節(jié)害蟲種群密度的作用。 常規(guī)方法施用或釋放帶毒昆蟲散布一定限量的病毒后，病原可在昆蟲種群間自行傳播。毒餌劑和散布帶毒蟲體具有較高的經(jīng)卵巢傳播的潛力，其他昆蟲或寄生物和捕食者有機(jī)械傳播病毒的潛能。,5.2 局限性,昆蟲病毒對害蟲的防治也有其局限性，如感染的潛伏期較長，一般從感染到致死需714天或更長時間，由于?；暂^強(qiáng)，殺蟲譜性較窄。如僅用于短期速效性防治，在經(jīng)濟(jì)上和當(dāng)前所獲效果上不如高效低毒的化學(xué)農(nóng)藥，如從害蟲綜合治理要求考慮，利用病毒防治害蟲具有重要的意義和前途。,謝謝大家！,5.2 影響病毒防治害蟲效果的環(huán)境因素,溫度 溫度可影響發(fā)病潛伏期的長短，NPV和CPV等的傳播適溫約為25，如將溫度從15提高到32，可減少棉鈴蟲(Heliothis zeae)NPV對該蟲的LT50從9到23天，減少LT80從29到11天。,(二)光線 紫外線對病毒的致病力有影響。在田間條件下，特別是用飛機(jī)噴灑病毒懸液的情況下，日光照射能影響制劑的效果。室內(nèi)試驗距紫外線源5cm，5min可使實(shí)夜蛾屬(Heliothis)的NPV全部失活，可使粉紋夜蛾的NPV在2h內(nèi)全部失效。田間GV制劑在日光暴曬的甘藍(lán)葉面經(jīng)1219h全部失效。昆蟲病毒制劑在田間的失效與日光特別是紫外線的關(guān)系最大。制劑中加用紫外線保護(hù)劑或其他輔劑可延長滯留而有助于增效，,(三)pH和土壤 病毒的活性與其繁殖環(huán)境的pH有關(guān)，實(shí)夜蛾屬的NPV在pH為2時經(jīng)30min或pH為12時經(jīng)24h活性大減。棉鈴蟲的NPV最好保存在pH為7的條件下。 病毒在土壤中有相當(dāng)高的穩(wěn)定性，施于土壤內(nèi)的NPV制劑在231周內(nèi)數(shù)量可無減少，粉紋夜蛾的NPV在土壤內(nèi)可保持活性達(dá)5年之久，不受雨水沖刷的影響，也不受正常pH和微生物分解作用的影響。因此，土壤成為這類病毒的貯存源，并可污染作物葉面，引起害蟲種群內(nèi)病毒病的流行。,自然條件下的爆發(fā),在自然條件下，昆蟲病毒病的發(fā)生常有突然暴發(fā)的現(xiàn)象。有人認(rèn)為蟲體內(nèi)本有潛伏病毒，一旦遇有一定的外因激發(fā)，便能誘導(dǎo)發(fā)病。第二種病毒的介入往往也可能促發(fā)潛伏病毒病。,主要內(nèi)容,前言 研究目的及意義 研究現(xiàn)狀 研究內(nèi)容及可行性 技術(shù)路線 研究時間計劃安排,灰白蠶蛾Ocinara varians Walker屬鱗翅目，蠶蛾科昆蟲，分布于廣東、廣西、四川、臺灣、海南等地，在華南地區(qū)危害小葉榕、黃葛榕、高山榕、菩提榕、木波蘿等主要園林樹木，是一種主要的園林害蟲。近年來，其為害日益嚴(yán)重。,13齡幼蟲取食葉肉，致葉片只剩下網(wǎng)葉脈，被危害葉片不久呈深褐色。4齡后的幼蟲取食葉片呈空洞或缺刻。末齡幼蟲食量大增，食光葉片及嫩梢，僅余樹干。,研究目的及意義,灰白蠶蛾是一種近年來為害比較嚴(yán)重的園林害蟲，而在對灰白蠶蛾的防治上以化學(xué)防治為主，使用的農(nóng)藥主要是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，不僅使害蟲容易產(chǎn)生抗藥性，而且大量殺死天敵，污染環(huán)境，危害居民的身體健康。其結(jié)果是消弱了生物防治的作用，更加凸現(xiàn)了3R問題的嚴(yán)重性。,研究目的及意義,昆蟲病毒作為生物防治中的一種，在近年來被多次證實(shí)是效果比較顯著的方法之一。通過對灰白蠶蛾核多角體病毒的研究，了解其生物活性、探討使用該病毒防治灰白蠶蛾的可能性，為殺蟲劑的生產(chǎn)及其應(yīng)用提供一定的依據(jù)。,研究現(xiàn)狀 灰白蠶蛾核多角體病毒 Ocinara varians Walker nucler polyhedrosis virus 屬桿狀病毒科、桿狀病毒屬、A亞組（蘇星等，1983）。 有關(guān)灰白蠶蛾核多角體病毒的研究，據(jù)目前手中掌握的資料顯示，在1983年林業(yè)科學(xué)的昆蟲集刊中，蘇星發(fā)現(xiàn)并命名了此病毒。但未見有人對其進(jìn)行系統(tǒng)性研究。,研究的具體內(nèi)容,1 灰白蠶蛾核多角體病毒的分離和鑒定 2 灰白蠶蛾核多角體病毒毒力的生物測定 3 不同蟲齡幼蟲對灰白蠶蛾核多角體病毒的敏感性 4 溫度、光、pH值對病毒活性的影響 5 感染灰白蠶蛾核多角體病毒的幼蟲發(fā)育與溫度的關(guān)系,獨(dú)創(chuàng)及新穎之處,首次對灰白蠶蛾核多角體病毒進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，明確該病毒的致病力，為在田間應(yīng)用防治灰白蠶蛾提供科學(xué)依據(jù)。 首次提出利用昆蟲病毒來防治園林重要害蟲灰白蠶蛾，填補(bǔ)了關(guān)于該蟲在生物防治方面研究的空白，為灰白蠶蛾的綜合防治開辟新道路。,已做過的前期工作,1 已經(jīng)熟練掌握灰白蠶蛾的飼養(yǎng)技術(shù)以及灰白蠶蛾核多角體病毒分離提取技術(shù) 2 目前對灰白蠶蛾多角體病毒外部形態(tài)特征已有初步了解 3 第一部分已經(jīng)完成，已經(jīng)抽提了病毒原液，并確定了其濃度 4 生測部分正在進(jìn)行中,技術(shù)路線,研究時間計劃,1 灰白蠶蛾核多角體病毒的分離和鑒定 （2005.12-2006.3） 2 灰白蠶蛾核多角體病毒毒力的生物測定 （2006.4-2006.5） 3 溫度、光、pH值對病毒活性的影響 （2006.6-2006.7） 4 不同蟲齡幼蟲對灰白蠶蛾核多角體病毒的敏感性 （2006.8-2006-9） 5 感染灰白蠶蛾核多角體病毒的幼蟲發(fā)育與溫度的關(guān)系 （2006.10-2006.11）,1 灰白蠶蛾核多角體病毒的分離和鑒定,病癥： 染病幼蟲食欲減退，行動遲鈍，發(fā)育緩慢，進(jìn)而體節(jié)腫脹，體色由灰褐色變?yōu)辄S褐色或深褐色，在后期病蟲常往上爬，最后以腹足倒掛在植物或養(yǎng)蟲器材上死亡。死亡后，皮膚微觸即破或自行破裂，流出黃白色的體液，體液內(nèi)充滿多角體。,1 灰白蠶蛾核多角體病毒的分離和鑒定,1.1 病蟲的收集 將采集的自然罹病灰白蠶蛾死蟲（經(jīng)預(yù)備試驗回感灰白蠶蛾幼蟲獲得同樣的病原體，符合病原微生物的柯克定律）經(jīng)粗步提純，感染健康幼蟲，待感染發(fā)病后，取瀕死幼蟲，并觀察病征。,1 灰白蠶蛾核多角體病毒的分離和鑒定,1.2 核多角體病毒的分離提取 1.3 核多角體病毒的電鏡觀察,2 多角體病毒毒力的生物測定,試驗方法 將供試毒源稀釋濃度依次為5個濃度（待定），分別將大小基本一致的黃榕葉片浸入上述5種濃度的病毒液中（對照組浸入清水）；上述黃榕葉片晾干后，放入飼養(yǎng)幼蟲的罐頭瓶里，每罐5頭，每個濃度處理10罐。在室內(nèi)平均溫度2528度條件下飼養(yǎng)灰白蠶蛾幼蟲。待灰白蠶蛾幼蟲取食