基因工程的基本操作程序.ppt

1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,一、目的基因的獲取,(一)、目的基因主要是_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子,（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫(kù)中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,3、人工合成,請(qǐng)閱讀P9第一和二兩段,限制酶,基因組DNA,基因重組,轉(zhuǎn)化細(xì)菌,體外包裝,1)基因組文庫(kù)(Genomic library),是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組后，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，這個(gè)群體就稱為該生物基因組文庫(kù)。其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫(kù)中直接獲取,1.基因文庫(kù),一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫(kù)中直接獲取,1.基因文庫(kù),cDNA( 互補(bǔ)DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，這個(gè)受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫(kù),2)cDNA文庫(kù) (cDNA library),基因重組,反轉(zhuǎn)錄酶,mRNA,cDNA,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫(kù)中直接獲取,按照外源DNA片段的來(lái)源： 從特定組織提取的染色體基因組DNA -基因組DNA文庫(kù)（總） mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝-cDNA文庫(kù)（部分）,基因文庫(kù)的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,基因文庫(kù)的分類,2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,：直接分離法,供體細(xì)胞中的DNA,許多DNA片段,運(yùn)載體,限制酶,受體細(xì)胞,產(chǎn)生特定性狀,導(dǎo)入,外源DNA擴(kuò)增,目的基因,分離,(鳥槍法),一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫(kù)中直接獲取,多用于原核生物,逆轉(zhuǎn)錄法,目的基因的信使RNA,目的基因,化學(xué)合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉(zhuǎn)錄,2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫(kù)中直接獲取,人工合成法（真核生物）,推測(cè),推測(cè),單鏈DNA,合成,基因組文庫(kù)的構(gòu)建,（2）.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,通過(guò)對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因, cDNA文庫(kù)的構(gòu)建-反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA,反轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,雙鏈DNA (目的基因),基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)(cDNA文庫(kù))比較,怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢?,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。 如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因, 概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng) 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),條件：_、 _、_ 、 _.等,原理：_,方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,四種脫氧核苷酸,一對(duì)引物,DNA聚合酶,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,過(guò)程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成與模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,3、人工合成法：,基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成,1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄,1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的一種蛋白質(zhì).,RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。,轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。,轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來(lái)，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái)。,不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質(zhì)。,：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能 編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列.包括啟動(dòng)子和終止子,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心,1、目的： 所需物質(zhì)：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因表達(dá)載體的組成：,復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因,它們各自的作用是什么?,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái),載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意,三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,過(guò)程：,優(yōu)點(diǎn),（2）基因槍法 （3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 方法：顯微注射法 程序：,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少 方法：,用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,（一）、檢測(cè),1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA .用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針 .使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過(guò)程:,歸納步驟,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,P15思考與探究,（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）,2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原抗體雜交,過(guò)程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納步驟,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫(kù) 利用PCR 化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體 目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法 目的基因的檢測(cè)與鑒定 檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯 鑒定：,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。 （3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和 。 （4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的 作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用 方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,答案：（1）a a （2）基因槍法（花粉管通道法） （3）植物組織培養(yǎng)（1分） 脫分化（去分化） 再分化 （4）耐鹽基因（目的基因） 一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）,1）以下說(shuō)法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái),C,練習(xí),2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,練習(xí),3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái) B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,練習(xí),4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,練習(xí),5）基因工程是在DN