《植物細(xì)胞培養(yǎng)》PPT課件.ppt

第六章 植物細(xì)胞培養(yǎng) Plant Cell Culture,第一節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)簡介,一、概念：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)彼此分離的細(xì)胞。 二、類型： 固體培養(yǎng)（solid culture）：在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。也稱靜止培養(yǎng)。 固體培養(yǎng)的特點(diǎn): 1）可以跟蹤單細(xì)胞生長與分裂的過程； 2）所得到的各個細(xì)胞團(tuán)均為單細(xì)胞形成，遺傳成分和生理特性具有一致性； 3）細(xì)胞生長速度較慢； 4）不能長期、連續(xù)、大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。,2. 液體培養(yǎng)（liquid culture）：在運(yùn)動的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。又稱懸浮培養(yǎng)（ suspension cell culture）。 有2種形式： 成批培養(yǎng)(batch culture)：一個容器的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞被分散到新的容器中繼續(xù)培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture)：在一個容器（或者系統(tǒng)）中連續(xù)不斷的培養(yǎng)植物細(xì)胞。,成批培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn),1）不能跟蹤單細(xì)胞的分裂和生長過程； 2）細(xì)胞生長速度較快； 3）可以長期、連續(xù)、大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。,第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用,進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究：通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)技術(shù)，人們可以連續(xù)觀察一個細(xì)胞的生長、分化和分裂的全過程，為人們研究細(xì)胞的生長、分化以及影響細(xì)胞生長、分化的條件提供了良好的實(shí)驗(yàn)體系。,植物細(xì)胞全能性的證明,2. 篩選變異體：在生產(chǎn)中，人們總是希望獲得具有某些抗性的品種，如抗病、抗蟲、抗鹽堿、抗鋁、抗除草劑等。通常的方法是在大量的植株中進(jìn)行選擇。這種方法不僅工作量大，而且效率低。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為突變體的篩選提供了快速有效的方法。在一個培養(yǎng)皿中，一次可以篩選20萬個細(xì)胞。 將具有抗性的細(xì)胞挑選出來以后，進(jìn)行培養(yǎng)、再生，即可獲得抗性植株。,3. 生產(chǎn)有用化合物：利用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以在室內(nèi)生產(chǎn)一些植物細(xì)胞合成的有用物質(zhì)，如色素、香料、藥物成分等。,第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的建立、維持和生長特點(diǎn),一、細(xì)胞培養(yǎng)的建立和維持 細(xì)胞培養(yǎng)通常是將植物材料接種在液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過搖蕩建立起來的。 建立起來的懸浮細(xì)胞必須適時繼代培養(yǎng)（subculture-將芽、愈傷組織、細(xì)胞等分成若干份，接種到新鮮的培養(yǎng)基中以擴(kuò)大群體的過程）。通過繼代，細(xì)胞就可以長期保持、繁殖，并且擴(kuò)大細(xì)胞的群體。,外植體,勻槳,過濾,培養(yǎng),液體培養(yǎng),振蕩,培養(yǎng)上清液,愈傷組織,液體培養(yǎng),繼代培養(yǎng),振蕩,愈傷組織(callus)是一群無明顯組織分化、分裂能力強(qiáng)的細(xì)胞。它是植物受到創(chuàng)傷后或在植物激素的誘導(dǎo)下形成的。,分化(differentiation)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能相同的細(xì)胞變成形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能互不同的細(xì)胞的過程，如分生組織細(xì)胞轉(zhuǎn)變成薄壁組織、維管組織、厚壁組織等。 脫分化(dedifferentiation)已分化、成熟的細(xì)胞（一般不再分裂）重新恢復(fù)分裂能力的過程。外植體形成愈傷組織的過程就是脫分化的過程。 再分化 (redifferentiation)愈傷組織形成其它組織或器官的過程,二、懸浮細(xì)胞的生長過程,1. 懸浮細(xì)胞生長的特點(diǎn) 細(xì)胞培養(yǎng)周期：兩次繼代培養(yǎng)所間隔的時間。 在一個細(xì)胞培養(yǎng)周期中，細(xì)胞的生長情況經(jīng)歷了慢快慢的過程（下圖）。,延滯期,快速生長期,靜止期,下降期,漸降期,生長量： 重量 細(xì)胞濃數(shù)量,延滯期：細(xì)胞繼代培養(yǎng)開始后的一段增長緩慢的時間。 快速生長期(對數(shù)生長期)：細(xì)胞數(shù)量、重量或體積直線上升的時期。 漸降期：細(xì)胞生長速度逐漸減慢的時期。 靜止期：新生的細(xì)胞數(shù)量與死亡的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到動態(tài)平衡的時期。 下降期：活細(xì)胞數(shù)量不可逆下降的時期。,云南紅豆杉細(xì)胞生長和蔗糖消耗動態(tài),蔗糖濃度,細(xì)胞干重,營養(yǎng)耗盡,與固體培養(yǎng)不同, 懸浮培養(yǎng)要求細(xì)胞達(dá)到一定的接種細(xì)胞密度 (cells/ml)， 一般為0.5-2.5105。密度高，細(xì)胞分裂快，延滯期短；密度低則相反，如果密度太低，則細(xì)胞不分裂，最后全部死亡。故懸浮培養(yǎng)時有一個最低起始細(xì)胞密度（minimum initial cell density）。 最低起始細(xì)胞密度=細(xì)胞能夠生長、分裂的最低接種密度。,影響最低起始細(xì)胞密度的因素,(1)植物種類：生長快、容易培養(yǎng)的植物（如大多數(shù)草本植物），其最低起始細(xì)胞密度比較低；相反，則高。 (2) 細(xì)胞的生理狀況：用快速生長期的細(xì)胞接種，則起始細(xì)胞密度可以比較低。 (3) 培養(yǎng)基： -基本培養(yǎng)基 -豐富有機(jī)營養(yǎng)：較多種類的氨基酸和維生素等） -合適的植物激素,-條件化培養(yǎng)基(conditioned medium) 條件化培養(yǎng)基=培養(yǎng)過幾天高密度細(xì)胞后的無細(xì)胞培養(yǎng)基。使用條件化培養(yǎng)基可以顯著降低起始細(xì)胞密度。 (4) 培養(yǎng)方式：采用看護(hù)培養(yǎng)（nurse culture）是降低最低起始細(xì)胞密度的有效方法之一。 看護(hù)培養(yǎng)（nurse culture）=將親本愈傷組織或高密度的懸浮細(xì)胞同低密度細(xì)胞一起培養(yǎng)，以促進(jìn)低密度細(xì)胞生長、分裂的培養(yǎng)方法。,Nurse Culture,（微孔濾膜）,細(xì)胞看護(hù)培養(yǎng),第三四節(jié) 單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),單細(xì)胞培養(yǎng)是培養(yǎng)彼此分離的單個細(xì)胞。 單細(xì)胞的培養(yǎng)難度較大，是研究和觀察細(xì)胞生長與分裂過程的有效方法。 常用方法：微室培養(yǎng)和平板培養(yǎng)。,一、微室培養(yǎng)(Culture in microchamber),微室培養(yǎng)是在懸滴培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。1955年DeRopp把含有細(xì)胞的液體培養(yǎng)基滴在玻璃板上以觀測單細(xì)胞的生長。但他沒有發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞分裂，發(fā)生分裂的是含有幾個細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)。 1957年，Torrey改進(jìn)了培養(yǎng)方法，采用微室培養(yǎng)。利用此培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)豌豆根尖單細(xì)胞，得到了含幾個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)。1960年，Jones用條件化培養(yǎng)基在微室中進(jìn)行懸滴培養(yǎng)煙草雜種細(xì)胞，得到了含30個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，并用錄象記錄了細(xì)胞分裂的全過程。,微室,載波片,石蠟,單細(xì)胞,微室培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長、分裂,二、平板培養(yǎng)（Plate culture）,此技術(shù)是1960年Bergamann首創(chuàng)，是在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)眾多單細(xì)胞的一種方法。,1. 細(xì)胞懸浮液的制備： 旺盛分裂期的懸浮細(xì)胞過濾 濾液離心 吸去部分上清液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度（大于最終接種密度: 51035105cell/ml）,2. 培養(yǎng)基的制備 配制培養(yǎng)基，但濃度為稀釋的倍數(shù)，高溫滅菌后冷至35備用。 條件化培養(yǎng)基的配制：懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液離心取上清液與高溫滅菌的培養(yǎng)基等量混合冷至35備用。,3. 平板培養(yǎng)的制作： 將單細(xì)胞懸浮液按比例與35的固體培養(yǎng)基充分混合均勻后，倒入無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基的厚度為5mm左右。蓋上蓋子，搖動、布勻，用Parafilme膜封口后，進(jìn)行培養(yǎng)。 4. 培養(yǎng)條件： 溫度為25，黑暗或弱光照。,平板培養(yǎng)的效果，可用植板率（plate efficiency）來衡量。 plate efficiency（%）=每個平板中新形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)/每個平板中接種的細(xì)胞數(shù)100,影響植板率的因素,(1)植物種類：生長快、容易培養(yǎng)的植物（如大多數(shù)草本植物），其植板率高；相反，則高。 (2) 細(xì)胞的生理狀況：用快速生長期的細(xì)胞接種，則植板率高。,（3）接種細(xì)胞密度：接種密度高，有利于細(xì)胞分裂，提高植板率。 接種密度過高，會使細(xì)胞團(tuán)之間相互靠近、接觸，這不僅造成計(jì)數(shù)困難，而且無法判斷細(xì)胞團(tuán)的歸屬，不利于細(xì)胞系克?。╟lone）的選擇。,煙草細(xì)胞接種密度和植板率之間的關(guān)系,(4) 培養(yǎng)基成分：用營養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基或條件化培養(yǎng)基，植板率高。 (5) 培養(yǎng)方式： 采用看護(hù)培養(yǎng)可以提高植板率。 平板培養(yǎng)為分離、篩選單細(xì)胞無性系提供了一個有效方法,第五節(jié) 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 生產(chǎn)次生代謝物質(zhì),Production of Secondary Metabolites by Large-scale Culture of Plant Cells,一、 植物次生代謝和次生代謝產(chǎn)物,（一）次生代謝和次生代謝產(chǎn)物 初生代謝：為維持植物正常的生長發(fā)育所必須的代謝，如呼吸作用、光合作用、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝、核酸和核苷酸代謝、脂肪代謝、激素代謝等。初生代謝過程中形成的各種產(chǎn)物稱為初生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定，在體內(nèi)容易發(fā)生轉(zhuǎn)化。,次生代謝：建立在初生代謝基礎(chǔ)之上的、對于植物正常的生長發(fā)育非必需的代謝，其代謝產(chǎn)物即為次生代謝產(chǎn)物。 次生代謝產(chǎn)物是小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時期的特異性，因?yàn)槭悄┒舜x產(chǎn)物，比較穩(wěn)定，可以在體內(nèi)積累。 植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物種類繁多，已經(jīng)分離、鑒定的有10萬個左右，這些次生代謝產(chǎn)物可分為苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、萜類、甾體及其甙、生物堿七大類。詳細(xì)情況可參閱中藥化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)等書。,鬼臼毒素（抗腫瘤）,苯丙素類,水飛薊素 ：治療急、慢性肝炎、肝硬化、中毒性肝損傷等）的良藥。,苯丙素類,天然色素，絳紅色。抗菌、抗炎、抗病毒、止血。用于化妝品生產(chǎn),紫草,紫草根,紫草素,醌類,蘆丁、槲皮素：治療心腦血管疾病藥物的主要成分。,槲皮素 R=H 蘆丁 R=蕓香糖,銀杏黃酮、大豆黃酮等也是防治心血管疾病的重要物質(zhì)。,黃酮類,生物堿,嗎啡,鎮(zhèn)痛作用,生物堿指來源于生物界的一類含氮有機(jī)化合物。,生物堿多具有顯著而特殊的生物活性,主要成分：嗎啡、可待因,海洛因 : 由嗎啡合成 藥物：鎮(zhèn)痛 毒品：麻痹、毒害神經(jīng)、破壞免役力，容易成癮,罌粟=鴉片,主產(chǎn)地：金三角地區(qū)（緬甸、老撾、泰國）、阿富汗、巴基斯坦、南美,麻黃堿：止咳平喘,小檗堿：抗菌消炎,奎寧：抗瘧疾,長春花,ajmalicine阿嗎堿 : $2000/kg Vinblastine長春堿 : $2 million/kg Vincristine長春新堿 : $15 million/kg,阿嗎堿,長春堿,長春新堿,紫杉醇,薯蕷皂甙元,皮質(zhì)醇 可的松 皮質(zhì)甾酮,皂素,（二）獲得次生代謝物的方法,植物次生代謝產(chǎn)物的重要性：色素、香料、藥物與保健品、食品添加劑、化工原料等。全球2/3的藥物直接或者間接來源于植物次生代謝產(chǎn)物。,1. 從植物中提?。嚎煽?，但受到資源的限制，會破壞野生資源；人工栽培則占用土地、受病蟲害、自然災(zāi)害等因素的限制。 2. 化學(xué)合成：產(chǎn)量高、成本低，但污染環(huán)境，而且有些物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以人工合成，如海南粗榧內(nèi)酯；有些雖然可以人工合成，但成本太高，如紫杉醇等。,尚未合成,成本太高合成,3. 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：植物細(xì)胞不僅具有形態(tài)全能性，而且也有化學(xué)全能性（在離體條件下可以合成整株植物能合成的物質(zhì)）。 優(yōu)點(diǎn)：不破壞、不依賴野生資源；不受環(huán)境因素的影響；環(huán)境污染??；不占用土地資源；產(chǎn)量可以調(diào)控等。是一種很有前途的方法。,1956年Routin和Nickell：首次提出植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的專利以來，在這方面做了很多研究，取得了不少進(jìn)展。主要成就： 證明植物細(xì)胞在離體條件下可以合成次生代謝物質(zhì)； 發(fā)現(xiàn)了提高細(xì)胞次生代謝物質(zhì)含量的方法； 可以對植物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)（=75噸）； 成功商業(yè)生產(chǎn)了少數(shù)次生代謝物質(zhì)。,75000L Bioreactor,藥用植物細(xì)胞工程普遍存在的問題： 產(chǎn)量不高、不穩(wěn),課堂作業(yè)（2012.10.16）： 請解釋植物細(xì)胞培養(yǎng)中的延滯期、最低起始細(xì)胞密度、看護(hù)培養(yǎng)和條件化培養(yǎng)基能促進(jìn)低密度細(xì)胞分裂等現(xiàn)象。 如果要用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)某種藥用植物的有效成分，你認(rèn)為應(yīng)該研究哪些技術(shù)環(huán)節(jié)？,二、 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)研究的過程,1.選擇外植體、誘導(dǎo)愈傷組織； 2. 通過含量分析、選擇高產(chǎn)細(xì)胞系； 3. 研究培養(yǎng)條件(達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)）； 4. 建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、優(yōu)化培養(yǎng)條件(達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)）；(參考3) 5. 小試；優(yōu)化培養(yǎng)條件(參考4) 6. 中試;優(yōu)化培養(yǎng)條件(參考5) 7. 大規(guī)模培養(yǎng)(參考6) 8. 工業(yè)化生產(chǎn)；產(chǎn)品分離、純化。,適宜的外植體,細(xì)胞系,高產(chǎn)細(xì)胞系,誘導(dǎo),選擇,高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)細(xì)胞系,優(yōu)化條件,放大培養(yǎng)/大發(fā)酵罐,高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),優(yōu)化條件,懸浮培養(yǎng)/三角瓶,高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),優(yōu)化條件,放大培養(yǎng)/小發(fā)酵罐,放大培養(yǎng)/中試,參考,參考,優(yōu)化條件,參考,高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),產(chǎn)品提取分離,植物細(xì)胞工程流程圖：,建立,建立,建立,建立,高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),工業(yè)化生產(chǎn),優(yōu)化條件,三、 提高次生代謝物產(chǎn)量的方法,盡管植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的研究進(jìn)行了50年，但真正用于生產(chǎn)的畢竟是少數(shù)（如紫草素、人參皂甙）。其重要原因是目標(biāo)化合物的產(chǎn)量低、不穩(wěn)定、成本高。因此，尋找提高次生代謝物產(chǎn)量的方法對于用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)次生代謝物極為重要。提高次生代謝物產(chǎn)量的主要途徑有：,1. 選擇高產(chǎn)細(xì)胞系,細(xì)胞系合成次生代謝物能力對用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)次生代謝物有決定性的影響。 （1）不同植物、不同單株、不同外植體： 一種次生代謝物常在多種植物中有，但含量不同； 在同一種植物中，不同植株之間會不同； 同一株植物上，不同部位由于生理差異，往往也有不同的次生代謝物合成能力。,紫杉醇：抗癌藥物,化學(xué)名：Paclitaxel ；商品名：Taxol,紅豆杉（Taxus）,紫杉醇的發(fā)現(xiàn),50年代末-60年代初：美國發(fā)現(xiàn)癌癥病人大量增加 60年代中期：美國食品與藥物管理局（FDA）制定計(jì)劃，廣泛篩選治療癌癥的藥物（動物、植物、微生物） 1969年: 美國農(nóng)業(yè)部（USDA）采樣員在Oregon洲采取到太平洋紫杉樹皮，后經(jīng)過篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈的抑制腫瘤的作用,1971年：美國北卡州的三角化學(xué)研究所的化學(xué)家成功地分離出活性物質(zhì)，起名Paclitaxel(紫杉醇)，并發(fā)布了它的化學(xué)結(jié)構(gòu)。沒有申請專利保護(hù) 1970S: 紫杉醇有很好的治療卵巢癌、乳腺癌的作用，但臨床實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致1人死亡，F(xiàn)DA否決了紫杉醇 1979年：愛因斯坦醫(yī)學(xué)院博士后Susan在Science上發(fā)表了紫杉醇抗腫瘤機(jī)理，重新激起人們對紫杉醇的興趣。 1980S：廣泛研究紫杉醇抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)對多種癌癥有效，特別是對耐藥性卵巢癌、乳腺癌（有效率45%），且毒副作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于當(dāng)時發(fā)現(xiàn)的其它抗癌物質(zhì)；發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致病人死亡的原因，并解決了問題。 1992年： FDA正式被批準(zhǔn)紫杉醇臨床用藥。,紅豆杉種類：全世界11種（北半球）。我國4種一變種：東北紅豆杉、 （中國）紅豆杉、云南紅豆杉、喜馬拉雅紅豆杉（西藏紅豆杉）、南方紅豆杉（中國紅豆杉的變種） 紫杉醇含量：干樹皮中0.01%（萬分之一） 數(shù)量：稀少，散生、不成林 生長：極為緩慢，50-70年成樹,紫杉醇：資源稀缺,純品：6000元/g；進(jìn)口針劑：2980元/支(30mg) 1997年（1998年）國產(chǎn)紫杉醇針劑-泰素，出廠價1600元/支(30mg)，進(jìn)口1980元/支,1999年，我國紅豆杉被列為一級保護(hù)植物 1992-2001年，云南紅豆杉遭到毀滅性破壞 農(nóng)民賣樹皮1元/公斤；商販5元/公斤賣給麗江漢德公司，麗江漢德公司生產(chǎn)半成品（氯仿提取物）， 1900元/公斤供應(yīng)給云南漢德。云南漢德生產(chǎn)紫杉醇，高于18萬美元/公斤賣給美國公司。零賣價還要更高。 100公斤樹皮能生產(chǎn)1公斤半成品；100公斤半成品可生產(chǎn)1公斤紫杉醇。,云南漢德生物技術(shù)有限公司非法提取、出口紫杉醇,出動武警追捕。因破壞紅豆杉，先后有50多人被捕，32人被判有期徒刑。公司負(fù)責(zé)人被重判重罰,據(jù)統(tǒng)計(jì)：分布在滇西橫斷山區(qū)中的300多萬棵紅豆杉，絕大部分在1992-2001年被剝皮死去。,漢德公司吳軍、李松、齊膺等從一九九九年九月十日至二00一十一月，采用以欺騙方式騙取出口批文實(shí)施出口和更換品名報(bào)關(guān)實(shí)施出口兩種方式，共走私紫杉醇成品67.9755公斤，共計(jì)人民幣96351526.05元。2002年10月22日檢察機(jī)關(guān)以非法經(jīng)營罪和偷稅罪提起公訴。判決：云南漢德生物技術(shù)有限公司犯非法經(jīng)營罪和走私珍稀植物制品罪，判處罰金人民幣2000萬元；被告人吳軍判處有期徒刑18年，并處罰金200萬元；被告人李松有期徒刑九年，并處罰金10萬元；被告人齊膺有期徒刑七年，并處罰金8萬元；被告人明強(qiáng)忠犯非法經(jīng)營罪，判處有期徒刑三年，緩刑四年，并處罰金5萬元。同時，對被凍結(jié)和扣押的款項(xiàng)及存放在漢德公司的紫杉醇13.1千克予以追繳、沒收，上交國庫4000多萬 。,種植紅豆杉是目前生產(chǎn)紫杉醇最可靠的方法 曼地亞紅豆杉,云南紅豆杉,東北紅豆杉,中國紅豆杉,南方紅豆杉,雜種紅豆杉,（2）通過細(xì)胞系進(jìn)行系統(tǒng)選擇： 細(xì)胞系在培養(yǎng)工程中，細(xì)胞系會出現(xiàn)變異，通過持續(xù)選擇，有可能不斷提高細(xì)胞系的生產(chǎn)能力。大量的試驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。,云南紅豆杉細(xì)胞系,黃白色細(xì)胞,深褐色細(xì)胞,云南紅豆杉細(xì)胞系統(tǒng)選擇的結(jié)果,含量與愈傷組織的顏色、質(zhì)地、生長速度有關(guān)系,紫草細(xì)胞培養(yǎng),Sinenxan A：R=Ac Sinenxan B：R=CH3CH2CO Sinenxan C：R=CH3CH2CH(CH3)CO,紫杉烷Baccatin III的結(jié)構(gòu) （紫杉醇的母核）,紫杉烷Sinenxan的結(jié)構(gòu),紫杉醇Taxol,（3）細(xì)胞誘變選擇細(xì)胞系：用射線（ X射線、射線、紫外線）或者化學(xué)誘變劑（如甲基磺酸乙酯EMS、硫酸二乙酯DES等）處理細(xì)胞，然后進(jìn)行篩選。如Deus用X射線處理長春花細(xì)胞，獲得了蛇根堿含量達(dá)2%的細(xì)胞系；Berlin等用化學(xué)誘變煙草細(xì)胞，獲得了生產(chǎn)肉桂酰腐胺能力提高了10倍的細(xì)胞系。 （4）細(xì)胞系遺傳改良：利用基因工程技術(shù)超量表達(dá)限速酶基因、阻斷分支代謝的基因表達(dá)，可以提高細(xì)胞系合成次生代謝產(chǎn)物能力。,紫杉二烯,單萜化合物C10,倍半萜化合物C15,其它二萜化合物,異戊二烯，5C,牻牛兒醇牻牛兒醇焦磷酸C20,乙酰輔酶A,牻牛兒醇焦磷酸，10C,法呢兒醇焦磷酸，15C,紫杉二烯環(huán)化酶,Science 330, 70 (2010);,植物甾醇、皂素和三萜類物質(zhì)的生物合成,2. 優(yōu)化培養(yǎng)基 （次生代謝物的產(chǎn)量=細(xì)胞生長量細(xì)胞合成代謝物的能力）,（1）基本培養(yǎng)基：不同的基本培養(yǎng)基對細(xì)胞生長和次生代謝物的合成影響很大?；九囵B(yǎng)基中N和P的濃度高往往有利于生長，但不利于次生代謝物的合成。 （2）植物激素：植物激素對次生代謝物生產(chǎn)的影響非常復(fù)雜，需要分別試驗(yàn)、優(yōu)化。一般2,4-D促進(jìn)細(xì)胞生長，但抑制代謝物的合成。如在有2,4-D存在時，長春花、蔓陀蘿、天仙子、罌粟等細(xì)胞不能合成生物堿，雞眼藤不能合成蒽醌。紫草細(xì)胞培養(yǎng)時，IAA能促進(jìn)紫草素的合成，而NAA，2,4-D則抑制其形成。但高濃度的2,4-D卻能促進(jìn)煙草中泛醌-10的合成。,蔗糖濃度的影響:,維生素的影響,NO3-：NH4+的影響,3. 飼喂前體物質(zhì)（precursor）,在細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)是以初生代謝物質(zhì)為原料，經(jīng)過一系列的化學(xué)轉(zhuǎn)化而合成的，因此，每種次生代謝產(chǎn)物都有一條生物合成途徑。向培養(yǎng)基中添加生物合成途徑的中間體物質(zhì)（前體物質(zhì)）是提高次生代謝物產(chǎn)量的一個有效方法。如紫杉醇（Taxol）：,紫杉醇結(jié)構(gòu)可以分為母核（baccatin III）和側(cè)鏈2部分,側(cè)鏈則是由苯丙氨酸與苯甲酸形成的；Baccatin III是二萜類化合物，而二萜類化合物的生物合成途徑已經(jīng)基本明確。,紫杉二烯,單萜化合物C10,倍半萜化合物C15,其它二萜化合物,異戊二烯，5C,牻牛兒醇牻牛兒醇焦磷酸C20,乙酰輔酶A,牻牛兒醇焦磷酸，10C,法呢兒醇焦磷酸，15C,試驗(yàn)證明，向培養(yǎng)基中添加紫杉醇合成的前提物質(zhì)（牦牛兒醇、牦牛兒醇基牦牛兒醇、苯甲酸、苯丙氨酸等）可以使紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇含量提高1-5倍；,向鬼臼細(xì)胞培養(yǎng)基中添加前提物質(zhì)使鬼臼毒素含量提高12倍。 在添加前體物質(zhì)之前，必須了解該次生代謝物的生物合成途徑。,4. 使用誘導(dǎo)子（elicitor）,誘導(dǎo)子=指能刺激細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。 誘導(dǎo)子分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子是指微生物，特別是致病微生物（活菌、高溫滅菌后的菌物或其勻漿物）、纖維素酶、果膠酶、微生物多糖等；非生物誘導(dǎo)子是指重金屬離子（Ag+, V2+, Hg2+, Cu2+）或Ca2+等。 誘導(dǎo)子在細(xì)胞培養(yǎng)的中后期（接近細(xì)胞最大生長期）加入。,5. 改善培養(yǎng)條件,培養(yǎng)條件對細(xì)胞生長和合成次生代謝物質(zhì)的影響因植物種類而異，無統(tǒng)一的規(guī)律，最佳培養(yǎng)條件需要通過試驗(yàn)才能確定。如光照可以刺激長春花細(xì)胞合成蛇根堿、銀杏細(xì)胞合成黃酮，卻抑制黃連細(xì)胞中小檗堿、紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇的合成。溫度對細(xì)胞生長和次生代謝物合成的影響往往是不一致的，如長春花和駱駝蓬細(xì)胞的最佳生長溫度分別是27和30，但合成生物堿的最佳溫度是分別是16和25，而胡蘿卜在25和28時細(xì)胞合成花色素的能力無差異。 除了溫度、光照外，培養(yǎng)基的酸堿環(huán)境也影響到次生代謝物的合成。如雷公藤細(xì)胞合成雷公藤素乙的能力在pH6.0時最強(qiáng)；番薯細(xì)胞合成色醇的能力在pH6.3時最大，在pH4.8時則不能合成；胡蘿卜細(xì)胞合成花色素的能力在pH4.5時最強(qiáng)，提高pH值則導(dǎo)致合成能力下降。,6. 改進(jìn)培養(yǎng)方法,（1） 兩步培養(yǎng)法：細(xì)胞生長與次生代謝物合成所需要的條件往往是不同的，并且不同步。對于生長和次生代謝物質(zhì)合成不同步的植物細(xì)胞（如次生代謝物質(zhì)在細(xì)胞生長后期積累），可以在前期采用促進(jìn)細(xì)胞生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，在后期采用促進(jìn)次生代謝物合成的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，從而兼顧細(xì)胞的生長量和次生代謝物的合成，達(dá)到提次生代謝物產(chǎn)量的目的。,云南紅豆杉細(xì)胞生長與紫杉醇含量動態(tài),紫杉醇含量,生長量,（2）兩相培養(yǎng)法：根據(jù)化學(xué)反應(yīng)平衡原理知道，產(chǎn)物的積累會抑制化學(xué)反應(yīng)正方向的速度（反饋調(diào)節(jié)），移去產(chǎn)物則可以促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)朝正方向進(jìn)行；同時，產(chǎn)物的積累還會對細(xì)胞生長有毒害。因此，如果能將次生代謝物收集起來，就可以促進(jìn)代謝物的合成。兩相培養(yǎng)可以解決這個問題。,兩相培養(yǎng)法有2種方式。 液固培養(yǎng): 液相是細(xì)胞和液體培養(yǎng)基，固相是能吸收次生代謝物的物質(zhì)，如樹脂、活性炭等。 液-液培養(yǎng):一層液相是細(xì)胞和液體培養(yǎng)基，另一層液相是能溶解次生代謝物的有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）。 這2種方法都可以減少培養(yǎng)基中次生代謝物濃度，防止負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而提高代謝物的產(chǎn)量。特別是在培養(yǎng)基中加入促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)次生代謝物向培養(yǎng)基中分泌的物質(zhì)（如DMSO）時，效果更好。 香竺葵細(xì)胞兩相培養(yǎng)（液-液培養(yǎng)）：倍半萜的產(chǎn)量提高了500倍。,7. 固定化細(xì)胞培養(yǎng) （immobilized cell culture） 固定化細(xì)胞培養(yǎng)是先將細(xì)胞固定在一些惰性基質(zhì)（如海藻酸鈣、聚酰胺、瓊脂糖、有機(jī)高分子泡沫、玻璃等）表面，并將其做成小塊或珠狀，再放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或放入柱形培養(yǎng)容器中，讓培養(yǎng)基循環(huán)通過柱形培養(yǎng)容器。,在普通的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時，細(xì)胞的生長周期比較短，一般每隔15-35天就必須繼代。而在固定化細(xì)胞培養(yǎng)時，細(xì)胞的培養(yǎng)周期可以達(dá)到90-180天以上，因而大大減少了細(xì)胞繼代培養(yǎng)的次數(shù)。 對于一些能將絕大部分次生代謝產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中的植物細(xì)胞，用固定化細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行次生代謝物生產(chǎn)是非常有意義的，這不僅可以減少對細(xì)胞的操作，有利于培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高產(chǎn)量，而且也簡化了產(chǎn)物的分離過程，從而可以降低生產(chǎn)成本。,辣椒細(xì)胞：辣椒素提高了5倍 野葛細(xì)胞：異黃酮提高了17.3倍 黃連細(xì)胞：小檗堿提高了11倍 香竺葵細(xì)胞：單萜增加了20倍,固定化培養(yǎng),第四節(jié) 毛狀根培養(yǎng)與次生代謝物生產(chǎn),毛狀根（hariy root, 發(fā)根）是植物的器官、組織或細(xì)胞在發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)下產(chǎn)生的細(xì)小、多分枝的不定根。,青蒿的毛狀根,煙草的毛狀根,毛狀根特點(diǎn)：生長快，不依賴激素。 毛狀根具有組織結(jié)構(gòu)，所以它對于生產(chǎn)一些需要細(xì)胞出現(xiàn)組織化才能大量合成的次生代謝產(chǎn)物特別有意義，是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的一個很有潛力的方法。,毛狀根,再生根,懸浮細(xì)胞,長春花,總生物堿,阿瑪堿,1986年：Mano Y.等建立的29個日本莨菪毛狀根無性系均能生產(chǎn)阿托品烷生物堿，從中選育出的克隆，其生長速度比正常植株高102倍，莨菪堿含量達(dá)1.3 %，為原植株根中含量的3倍。 1987年：Yochikawa等人通過誘導(dǎo)人參毛狀根，其生長速度為用外源激素誘導(dǎo)根的2倍，人參皂甙含量達(dá)干重的0.95%，為天然根的2倍(0.4% )以上。 1990年：Furuga等用20噸的發(fā)酵罐進(jìn)行人參毛狀根的培養(yǎng)，每月產(chǎn)量為4噸的新鮮產(chǎn)物。,1993年：孫敏等誘導(dǎo)出蘿芙木的毛狀根，從296個無性系中篩選到4個生長快、分支多的蘿芙木轉(zhuǎn)化根系，其中一個的利血平含量是干重的0.124%，為原植株的3倍。 1996年：芮和愷等誘導(dǎo)的黃芪毛狀根16 d內(nèi)可增殖404倍。 1997年：鄭志仁等用發(fā)酵罐大量培養(yǎng)黃芪毛狀根，3星期后，毛狀根生長量分別達(dá)到35倍。 1997年：黃遵錫從短葉紅豆杉誘導(dǎo)出毛狀根，選育出的5株無性系20d 后生物量增加9倍，紫杉醇含量是愈傷組織的1.3- 8.0倍。,毛狀根的誘導(dǎo),發(fā)根農(nóng)桿菌，革蘭氏陰性土壤桿菌，自然界中普遍存在，其特點(diǎn)是能感染雙子葉植物，并引起植物形成腫瘤或者毛狀根。,毛狀根誘導(dǎo)機(jī)理：,發(fā)根農(nóng)桿菌中Ri質(zhì)粒上一段DNA（T-DNA，transfer DNA，含有rolA, roB, rolC, rolD genes)轉(zhuǎn)到了植物細(xì)胞基因組中，引起植物細(xì)胞毛狀根。,毛狀根誘導(dǎo)過程：,1. 外植體選擇和表面消毒； 2.發(fā)根農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng) 保存的農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基上化平板； 單菌落接種在液體YEP培養(yǎng)基中，28/200rpm, 2 days； 1:30-50放大培養(yǎng),28/200rpm,6-7h (OD600=0.5-0.8)； 離心收集菌液，懸浮在MS0培養(yǎng)基中。 3. 感染（5-30min) 4. 共培養(yǎng)（在無激素、有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-5天） 5.毛狀根形成（在無激素、有抗生素培養(yǎng)基）,毛狀根的形成,毛狀根誘導(dǎo)是發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因，誘導(dǎo)效率受到很多因素的影響,長春花毛狀根的誘導(dǎo),形態(tài)不一的毛狀根,毛狀根選擇和培養(yǎng)條件優(yōu)化,生長速度不同,Ajmalicine (a) and serpentine (b) production on the basis of mg/g dry weight of different hairy root clones of C. roseus var. Prabal,代謝產(chǎn)物合成能力不同,蛇根堿,阿瑪堿,第五節(jié) 生物轉(zhuǎn)化(Biot