DB33T 542-2005 水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的測定方法 氣相色譜-二級質(zhì)譜法.doc

DB33/T 2005浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2005-04-05實施2005-03-04發(fā)布水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的測定方法氣相色譜-二級質(zhì)譜法Determination of chloramphenicol residues in aquatic productGas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (GC-MS/MS )DB33/T 5422005DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 67.120.30X 20備案號：1DB33/T 5422005前 言本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A和附錄B均為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司、浙江工商大學(xué)本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人： 陳自力、勵建榮、廖上富、盛華棟、何喬桑、魯燕驊。II引 言目前國內(nèi)外特別是歐盟國家對水產(chǎn)品中氯霉素殘留監(jiān)控特別嚴(yán)格，而且允許殘留量都非常低，一般在1g/kg以下。目前一般常用的檢測標(biāo)準(zhǔn)都采用氣相色譜法（GC-ECD）、液相色譜法（HPLC-UV）、酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）及氣-質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS），氣相色譜法（電子捕獲檢測器）雖然能滿足靈敏度的要求，但易出現(xiàn)假陽性、陽性結(jié)果需進(jìn)一步確證；液相色譜法（HPLC）雖操作簡單，但靈敏度不高；酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高等優(yōu)點，但容易產(chǎn)生假陽性，一般只適用進(jìn)行樣品粗篩，陽性結(jié)果需進(jìn)行確證。本方法采用氣相色譜離子阱時間串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中氯霉素，靈敏度高，確證率高，穩(wěn)定性好。水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的測定方法氣相色譜-二級質(zhì)譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的測定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 原理樣品經(jīng)乙酸乙酯提取并濃縮，提取物溶于水，用正己烷脫脂，C18固相萃取柱凈化，硅烷化試劑衍生化后，用氣相色譜-二級質(zhì)譜測定，外標(biāo)法定量。4 試劑4.1 所有試劑在氯霉素出峰處應(yīng)無干擾峰，最好選擇優(yōu)級純或色譜純試劑。4.2 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度99。4.3 甲醇：色譜純。4.4 乙酸乙酯：色譜純。4.5 正己烷：優(yōu)級純。4.6 氯仿：分析純。4.7 乙腈：色譜純。4.8 無水硫酸鈉：分析純，650灼燒4h，冷卻后貯于密閉容器中備用。4.9 氯化鈉：分析純。4.10 4氯化鈉溶液：稱取氯化鈉20g，加水溶解，稀釋到500mL。4.11 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.050Og，用甲醇溶解并定容至100mL，配成濃度為500g/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4冰箱中保存，保存期不超過3個月。臨用前，取此貯備液，用甲醇稀釋成濃度為0.100g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4.12 衍生化試劑：N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)體積比991。4.13 水:實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水標(biāo)準(zhǔn)。5 儀器5.1 實驗室常規(guī)儀器、設(shè)備及下列各項。5.2 氣相色譜質(zhì)譜儀：電子轟擊源（EI）,離子阱串聯(lián)質(zhì)譜。5.3 電子天平：感量0.0001g。5.4 均質(zhì)機(jī)。5.5 離心機(jī)。5.6 電熱恒溫水浴鍋。5.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。5.8 雞心瓶：50mL、100mL。5.9 離心管：50mL。5.10 刻度離心管：5mL，具塞。5.11 氮吹儀。5.12 C18固相萃取柱，300mg。5.13 固相萃取裝置。5.14 無水硫酸鈉柱：砂芯玻璃層析柱中裝無水硫酸鈉5g。6 測定6.1 色譜條件色譜柱：VF-5MS（30m0.25mm0.25m）石英毛細(xì)管柱或相當(dāng)者。載氣：高純氦氣（大于99.999%），恒流1.0mL/min；柱溫：程序升溫，150恒溫1min，以20/min速率升至270，保持5min；進(jìn)樣口溫度為260；無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1L。6.2 質(zhì)譜條件：離子阱溫度200；傳輸線溫度250；歧管溫度45；光電倍增管電壓補(bǔ)償200Volt；燈絲電流80A；質(zhì)量掃描范圍：99-250m/z； EI全譜監(jiān)測離子：225、242、361、451；二級質(zhì)譜母離子225；二級監(jiān)測離子208；CID電壓：0.7Volts；定量方法：選擇208m/z為定量離子，外標(biāo)法定量。7 測定步驟7.1 樣品預(yù)處理魚去鱗、皮，沿背脊取肌肉；蝦去頭、殼、附肢，取可食肌肉部分；蟹、中華鱉等取可食肌肉部分；樣品切成為不大于0.5cm0.5cm0.5cm的小塊后混勻，放置冰箱中冷凍貯存?zhèn)溆谩?.2 提取將樣品解凍，稱取樣品5g(精確到0.001g)，置于50mL離心管中，加入乙酸乙酯20mL，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)1min，分散均勻，以4000r/min離心3min，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到100mL雞心瓶中。再向離心管中加乙酸乙酯10mL，用原均質(zhì)機(jī)均質(zhì)混合1min，4000r/min離心3min，合并乙酸乙酯提取液于100mL細(xì)口雞心瓶中，于40水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。7.3 脫脂凈化向雞心瓶中加1mL甲醇振蕩溶解殘留物，再加入15mL正己烷和25mL4氯化鈉溶液，蓋塞振蕩混合1min，充分混合提取脂肪，轉(zhuǎn)移到另一50mL離心管中，4000r/min的速度離心2min，除去上層正己烷相并棄去。再向水相中加10mL正己烷，重復(fù)提取一遍，棄去正己烷相。水相中加入15mL乙酸乙酯，旋渦混合2min，3000r/min離心3min，吸取乙酸乙酯層，經(jīng)過無水硫酸鈉柱脫水過濾于50mL雞心瓶中。再向水相中加入5mL乙酸乙酯，重復(fù)上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗無水硫酸鈉柱，合并提取液于50mL雞心瓶中，在40水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。對于凈化不完全的樣品可經(jīng)C18固相萃取柱進(jìn)一步凈化。加入2mL乙酸乙酯溶解提取物并轉(zhuǎn)移于5mL具塞離心管中，用1mL乙酸乙酯洗滌雞心瓶，合并乙酸乙酯，于5055的砂浴中吹氮蒸發(fā)至近干，再用1mL乙酸乙酯洗滌離心管壁并吹干。注意防潮。7.4 C18柱凈化注意：以下步驟必須連續(xù)做完，切莫讓吸附劑變干。給每個樣品準(zhǔn)備一根C18柱，順序用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗處理C18柱，棄掉洗滌液。用5mL體積分?jǐn)?shù)為5的乙腈水溶液溶解7.3中在40水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干的提取物，吸取水溶液裝入C18柱過柱，棄掉流出液。注意流速保持每秒一滴，否則凈化效果和回收率都較差。用1mL水淋洗雞心瓶2遍，并將淋洗液加入C18柱過柱，棄掉流出液。用5mL水淋洗C18柱，讓洗滌液完全流出C18柱，用微氮吹干。用乙腈將C18柱中的氯霉素洗脫，洗脫2次，每次1.5mL，合并洗脫液于5mL具塞離心管中。在溫度5055的砂浴中，用氮氣吹除乙腈至近干，再用1mL乙腈洗滌離心管壁并用氮氣吹干。注意防潮。7.5 衍生化7.5.1 試樣的衍生化向干的殘留物中加100L衍生化試劑，蓋塞并旋渦混合10s，在70烘箱中反應(yīng)30min。再在5055砂浴中用氮氣流吹除多余的試劑，至樣品管剛好吹干為止(過長的吹干時間可導(dǎo)致?lián)p失分析物)。加入0.5mL正己烷，旋渦混合10s，供氣相色譜質(zhì)譜分析用。7.5.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生化取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液于5mL具塞離心管中，在溫度5055的砂浴中，用氮氣吹除溶劑至干。以下按7.5.1的步驟操作。7.6 樣品測定分別注入1L適當(dāng)濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)硅烷化衍生物溶液及樣品提取物硅烷化衍生物溶液于氣相色譜質(zhì)譜儀中，按上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。7.7 定性測定進(jìn)行樣品測定時，如果檢出色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相一致，并且在樣品質(zhì)譜圖中，二級質(zhì)譜選擇的定性離子均出現(xiàn)，而且待測樣品的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品的豐度比相一致，可確證該樣品含氯霉素。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物的二級質(zhì)譜總離子流圖和二級質(zhì)譜圖見附錄A。7.8 定量測定以208為定量離子，外標(biāo)法定量。7.9 平行試驗按以上步驟對同一樣品進(jìn)行平行試驗測定。7.10 空白試驗除不稱取試樣后，均按上述步驟進(jìn)行。7.11 結(jié)果計算結(jié)果按式（1）計算：（1）式中：X試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生化定容后溶液氯霉素衍生物組分濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；A樣品中氯霉素衍生物的峰面積；AS標(biāo)樣中氯霉素衍生物的峰面積；V樣品溶液衍生化后定容體積，單位為毫升（mL）；m樣品溶液衍生化后定容溶液所代表試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。注：計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。通常的玻璃器皿洗滌程序?qū)τ趶牟ＡП砻娉ズ哿柯让顾夭豢偸呛苡行У?，建議使用甲醇淋洗所有玻璃器皿，以避免污染問題。均質(zhì)機(jī)清洗方法，先用大量水浸洗，再用甲醇浸洗，最后用蒸餾水浸洗。 附錄A（資料性附錄