DB51T 659-2007 牛奶中青霉素殘留檢測方法-酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法.doc

NY DB四川省質量技術監(jiān)督局 發(fā)布2007-05-01實施2007-03-17發(fā)布牛奶中青霉素殘留檢測方法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法Determination of Residues Penicillins in Milk by Enzyme-linked Immunosorbent AssayDB51/T 6592007四川省地方標準ICS：65.020.30備案號：1DB51/T6592007目 次前言II1 范圍32 規(guī)范性引用文件33 制樣33.1 樣品的制備33.2 樣品的保存34 測定方法34.1 方法提要或原理34.2 試劑和材料34.3 儀器和設備44.4 測定步驟44.5 結果計算和表述45 檢測方法靈敏度、準確度、精密度55.1 靈敏度55.2 準確度55.3 精密度5I前 言本標準按GB/T1.12000 標準的結構和編寫規(guī)則進行編制本標準由四川省畜牧食品局提出并歸口本標準由四川省質量技術監(jiān)督局批準本標準起草單位：四川省獸藥殘留監(jiān)控中心、四川省獸藥監(jiān)察所本標準主要起草人：楊松沛、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艷麗、王海波、吳曉嵐牛奶中青霉素殘留檢測方法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法1 范圍本標準規(guī)定了牛奶中青霉素殘留量檢測的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測定法。本標準適用于牛奶中青霉素的殘留量的快速篩選檢測。對于可疑樣品需用確證法確認。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 1.1-2000 標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)GB/T 6682-1992 分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法農牧發(fā)20031號 獸藥殘留試驗技術規(guī)范（試行）3 制樣3.1 樣品的制備 取適量新鮮的空白或供試牛奶，渦旋混合使之均勻，密封。3.2 樣品的保存-20以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩? 測定方法4.1 方法提要或原理牛奶中殘留的青霉素用PB緩沖液提取，酶聯(lián)免疫吸附測定法測定,其基本原理是抗原抗體反應。酶標板的微孔包被有偶聯(lián)抗原，標樣或樣品中的青霉素與酶標記抗原競爭青霉素特異性抗體。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結合的酶標記抗原。加入底物液，結合到板上的酶標記物將底物轉化為有色產物。加入終止液，在450nm處測定吸光度值，吸光度值與試樣中青霉素濃度呈反比。 4.2 試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。 4.2.1 正己烷4.2.2 PB緩沖液的配制 稱取51.6gNa2HPO4.12H2O和8.7gNaH2PO4.2H2O，用1000mL水溶解（pH=7.2）即可。4.2.3 青霉素試劑盒（采用官方備案的試劑盒）4.2.6.1 青霉素系列標準溶液 0mg/mL 、0.1mg/mL、0.3mg/ml、0.9mg/mL、2.7mg/mL、8.1mg/mL4.2.6.2 酶標板 8條12孔，包被有偶聯(lián)抗原4.2.6.3 酶標記物4.2.6.4 青霉素抗體 4.2.6.5 底物溶液A4.2.6.6 底物溶液B4.2.6.7 濃縮洗滌液 臨用前用水稀釋二十倍作為洗滌液4.2.6.8 終止溶液4.3 儀器和設備4.3.1 酶標儀（配備450nm濾光片）4.3.2 天平 感量0.01g4.3.3 分析天平 感量0.00001g4.3.4 漩渦混合儀4.3.5 振蕩器4.3.6 組織勻漿機4.3.7 冷凍離心機4.3.8 氮吹儀4.3.9 離心管 20mL 4.3.10 微量移液器 單道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50250mL 4.4 測定步驟4.4.1 試料的制備試料的制備包括： 取混勻后的供試樣品,作為供試試料。 取混勻后的空白樣品,作為空白試料。 取混勻后空白樣品,添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試料。4.4.2 提取和凈化精密量取1mL試料于離心管中，精密加入4mL0.1moL/LPB緩沖液(pH=7.2)，充分混合后加入5mL正己烷振蕩提取10min，于8000r/min15離心10min,取出下層液體50mL用于分析。4.4.3 樣品測定程序（2026條件下操作）4.4.3.1 使用前將試劑盒置于室溫（2026）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的酶標板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于28。將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做兩個平行實驗。4.4.3.2 加入50 mL標準溶液或試樣溶液到微孔底部，每孔再加入50mL青霉素抗體溶液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，37環(huán)境中反應30min。4.4.3.3 倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。每孔加入250mL洗滌液，10s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。4.4.3.4 加入100mL酶標記物到微孔底部，用蓋板膜封板，37環(huán)境中反應30min。取出酶標板，如前述洗板5次。4.4.3.5 加入50mL底物溶液A和50mL底物溶液B到微孔中，輕輕振蕩混勻37環(huán)境避光顯色15min。4.4.3.6 加入50mL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處，測定每孔吸光度值（OD值）。4.5 結果計算和表述BB0所獲得的標準或樣品吸光度值的平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比給出的吸光度值，以式（1.1）表示： 百分吸光度值= 100% 1.1 式中:B為標準溶液或供試樣品的平均吸光度值；B0為零濃度標準溶液的平均吸光度值。以X軸為標準溶液中青霉素濃度(mg/L)的自然對數(shù)，Y軸為百分吸光度值，在半對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線圖。相對應的供試樣品的濃度（mg/L）可以從標準曲線上查出。也可以求出回歸曲線的方程，計算未知樣品中青霉素的濃度。如果有專業(yè)計算機軟件可直接求出供試樣中青霉素的濃度。注：檢測結果小于2.0g/L時，可判為未檢出，大于2.0g/ L時，判為可疑