FLT3基因動態(tài)監(jiān)測在急性髓系白血病治療中的應用.doc

FLT3基因動態(tài)監(jiān)測在急性髓系白血病治療中的應用 作者：李樹，王彤，王杰，李軍，張璐 【摘要】 微小殘留病(Minute Residual Disease, MRD)是急性髓系白血病(Acute myeloid leukaemia, AML)復發(fā)和妨礙長期無病生存率的重要原因。本研究旨在探討FLT3基因在AML發(fā)病中的作用及對微小殘留病(MRD)檢測的意義。 應用PCR技術檢測了125例AML患者在化療與異基因造血干細胞移植（alloHSCT）治療前后FLT3基因的表達，并對FLT3基因陽性者進行了隨訪觀察。結果表明： PCR檢測FLT3基因的靈敏度為10-4；AML初診患者中FLT3基因的陽性表達率為69.6%；完全緩解(CR)患者FLT3表達基因陽性表達率44.90%，FLT3轉為陰性者占48.98%；FLT3表達無改變者占6.12%；復發(fā)者FLT3基因表達轉為陽性，而未緩解者FLT3持續(xù)陽性，治療前FLT3陽性AML患者完全緩解率低于FLT3基因表達陰性患者，兩者有顯著性差異(p<0.05)。獲得CR的FLT3陽性AML患者的復發(fā)率顯著高于FLT3陰性患者(p<0.05)。結論：FLT3基因表達與白血病發(fā)生有關，PCR動態(tài)檢測AML患者治療前后FLT3表達水平,可作為判斷AML白血病預后和監(jiān)測微量殘留病的一項指標。 【關鍵詞】 急性髓系白血病 Dynamic Detection of FLT3 Gene in Patients with AML and Its Significance Abstract Minimal residual disease (MRD) is an important cause of relapse and diseasefree survival time decrease in patients with acute myeloid leukemia (AML). This study was aimed to explore the role of FLT3 gene in AML pathogenesis and its significanse for detection of MRD. Using genomic PCR, 125 AML patients were detected for FLT3 gene expression before and after chemical therapy and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT), meantime the AML patients with FLT3 positive expression were observed by followup. The results showed that the sensitivity of PCR was 10-4 in FLT3 gene detection; the rates of FLT3 positive expression were 69.6% and 44.90% in the newly diagnosed AML patients and complete remission (CR) patients respectively. The rate of FLT3 expression coverted to negative was 48.98% in treated AML patients, while no change of FLT 3 expression was found in 6.12% treated patients. The FLT3 expression converted to positive in relapsed patients, and FLT3 expression remains positive in nonremitted patients. The CR rate in FLT3 positive expression patients before treatment was significantly lower than that in FLT3 negative expression patients, the difference of which was statistically significant (p<0.05). The AML relapse rate in FLT3 positive patients was significantly higher than that in FLT3 negative expression patients (p<0.05). It is concluded that FLT3 gene expression is related to leukemia pathogenesis; the dynamic levels of FLT3 expression before and after treatment can be used for estimating prognosis of AML patients and detecting MRD. Key words AML; FLT3 gene; MRD; leukemia prognosis; PCR J Exp Hematol 2007; 15(4):705-708 急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia, AML)是發(fā)病率最高的一種造血系統(tǒng)惡性腫瘤，化療方法的完善和造血干細胞移植技術的開展使AML的預后有了很大改善，但仍有不少患者復發(fā)。目前認為，微小殘留病（MRD）是白血病治療緩解后復發(fā)的最重要的原因1。近年來分子生物學技術的發(fā)展，為常規(guī)骨髓形態(tài)學檢查難以檢測的MRD提供了新方法，然而目前尚缺乏合適的MDR的檢測指標。FLT3是與AML發(fā)生及預后相關的一種重要因子2。因此，我們把FLT3作為MRD的基因標志，應用PCR技術監(jiān)測AML的治療過程，并探討其臨床意義。 材料和方法 標本來源 中國實驗血液學雜志 J Exp Hematol 2007; 15(4)FLT3基因動態(tài)監(jiān)測在急性髓系白血病治療中的應用標本來自1998年3月至2005年10月中國醫(yī)科大學和沈陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液科門診及住院治療的125例AML患者。所有患者均經形態(tài)學及骨髓活檢確診。125例AML患者中男72例，女53例，平均年齡13歲(3個月-61歲)，按FAB分型為M0 7例、M1 9例、M2 31例、M3 8例、M4 18例、M5 26例、M6/7 10例和M7 16例。對初診時具有FLT3基因表達陽性的87例患者分別在初診、完全緩解及緩解后3個月、6個月各取骨髓或外周血標本1次，以進行FLT3基因動態(tài)檢測。對照組為同期就診的非白血病(淋巴瘤、過敏性紫癜、免疫性血小板減少性紫癜）患者及健康供者，男、女各10名，平均年齡18(9-57)歲。 治療方案及療效標準 采用標準的DA (柔紅霉素+阿糖胞苷) 、HA (高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)方案誘導緩解，難治、復發(fā)患者則采用米托蒽醌或去甲氧柔紅霉素或安吖啶+阿糖胞苷誘導緩解，對于隨后相繼以原方案及中等劑量阿糖胞苷鞏固強化治療。對于M3患者則采用全反式維甲酸誘導分化達完全緩解后，給予AML方案鞏固強化治療。62例患者在完全緩解后行親緣或非親緣供者alloBMT。療效判斷標準按照張之南主編的血液病診斷及療效標準3。 基因組DNA的提取 對患者骨髓或健康志愿者外周血標本采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用傳統(tǒng)酚/氯仿/異丙醇法抽提DNA。核酸蛋白測定儀測定吸光度值為2.37-2.69，調整DNA濃度為200 ng/l。 -70保存?zhèn)溆谩?PCR引物及PCR擴增產物 針對FLT3基因內部重復串聯結構主要發(fā)生在11號外顯子4，在11號外顯子近端和遠端分別設計引物11F和11R，擴增產物為大小133 bp 。同時設計對照組actin引物actin F和actin R，擴增產物為305 bp。以上引物均由寶生物制品公司合成，引物序列為： 11F： 5CAATTTAGGTATGAAAGCC3； 11R： 5CAAACTCTAAATTTTCTCT3 ； actin F：5CTTCTACAATGAGCTGCGTG3； actin R：5TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3 PCR反應體系50 l , 包括上、下游引物各0.2 mol/L, dNTPs 0.25 mmol/L, Taq DNA 聚合酶2.5 U, 模板DNA 200 ng。反應條件為94變性3分鐘后，94 1分鐘, 60 1分鐘, 72 1分鐘，35個循環(huán)，最后72延伸10分鐘。取PCR 產物13 l，加溴化乙錠2 l，于2%瓊脂糖凝膠上電泳20分鐘， pBR322 (Hind )作為標志物，用紫外投射儀分析圖像并照相。用QIA quick Gel Extraction試劑盒(Qiagen公司產品)回收純化PCR產物，由中國刑警學院法醫(yī)系測序。所得序列資料在線使用Blast進行同源性比對分析。 統(tǒng)計學分析 患者全部資料包括返院復查或信訪資料輸入計算機用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件生命表法進行統(tǒng)計。 結 果 PCR檢測FLT3基因的靈敏性 取FLT3基因表達陽性的AML患者的樣本1 g，按110連續(xù)稀釋DNA，然后行PCR擴增，確定本實驗擴增FLT3的靈敏度為10-5以上(總DNA 1 g時設為1)，即100 pg (結果未顯示)。 FLT3基因在AML初診患者中的表達 FLT3基因經PCR擴增后電泳，在133 bp位置出現特異性擴增帶。結果顯示，125例患者中87例呈FLT3基因表達陽性，占69.6%（表1）。 DNA測序及Blast比對分析結果證實， 在FLT3陽性標本均未見重復序列、點突變及插入（結果未顯示）。 AML治療后FLT3基因表達情況 治療前FLT3基因表達陽性的87例AML患者，經DA或HA標準化療1-2個療程或維甲酸誘導(M4)治療2個月后，49例達完全緩解（CR），其中22例FLT3表達減弱，占44.90%；24例FLT3轉為陰性，占48.98%；3例無改變，占6.12%。隨訪3-18個月，16例復發(fā)者FLT3基因表達轉為陽性，2例在臨床復發(fā)前1-2個月FLT3已呈陽性表達。38例未獲緩解者，FLT3持續(xù)陽性。而38例治療前FLT3陰性患者，經同樣方案治療后33例達到CR；隨訪3-18個月后2例復發(fā)，FLT3基因表達轉為陽性。此結果表明FLT3與AML發(fā)病及疾病狀態(tài)有關，同時也反映出FLT3基因表達與MRD有關。 FLT3基因表達與預后的關系 治療前FLT3基因表達陽性的87例AML患者經2個月治療，49例達CR，完全緩解(CR)率為56.32%，低于FLT3基因表達陰性組的86.84%(33/38)，統(tǒng)計學分析顯示兩者有顯著性差異(p<0.05)。49例獲CR的FLT3基因表達陽性AML患者在緩解期有25例仍可檢測出FLT3基因，此25例雖經正規(guī)定期強化治療及親緣或非親緣供者alloBMT，但均于1年內復發(fā)，復發(fā)時間平均6.5個月(2-11個月)，復發(fā)率為58.93%。而24例獲CR的FLT3基因表達陰性AML患者，在CR后1年內復發(fā)率為25.0% (6/24)，FLT3基因表達陽性AML患者CR后1年內復發(fā)率顯著高于FLT3基因表達陰性患者(p<0.05)（表2）。 討 論 人FLT3基因定位于染色體13q12，是型酪氨酸激酶受體(RTKm)成員之一。FLT3與配體結合后，發(fā)生同源二聚化，使激酶區(qū)接近酪氨酸殘基自主磷酸化，引起Ras和STAT5信號轉導途徑激活，從而轉導細胞分裂信號。正常情況下，FLT3基因存在于早期造血組織，與造血細胞的生長、增殖、凋亡有關5。FLT3基因發(fā)生突變，可破壞正常血細胞的增殖分化與凋亡，是AML中突變率最高且與預后相關的重要因子6。本研究采用PCR技術檢測了125例AML患者中FLT3基因表達情況，發(fā)現陽性率69.6%，與文獻報道一致56，提示FLT3基因在大多數AML中表達陽性。目前化療及造血干細胞移植是治療AML的主要方法，MRD是治療后復發(fā)的主要原因之一，測定MRD是指導緩解后治療及判斷預后的關鍵。本研究結果顯示，在大多數AML患者中FLT3基因表達陽性，因此FLT3可作為檢測AML殘留白血病的一個重要標志。 隨著急性白血病化療方案的改善和造血干細胞移植的進展，急性白血病的完全緩解(CR)率明顯提高。然而仍有許多CR患者在數年內復發(fā)，其主要原因是血液學CR后體內仍殘留106-109白血病細胞，稱為微小殘留病(MRD)?，F在普遍認為MRD是血液學CR乃至持續(xù)完全緩解(CCR)期間白血病復發(fā)的根源7。目前檢測MRD 的方法主要有3種：熒光原位雜交、PCR 和流式細胞術，其中以PCR 法最敏感，臨床應用最廣。據文獻報道靈敏度可高達106-107水平，比染色體技術更加靈敏8。在本實驗中我們利用PCR技術探索了FLT3基因的最低檢出值，結果顯示樣本中提取的DNA稀釋至100 pg時仍可以檢測到FLT3基因表達，說明PCR方法可以檢出白血病患者FLT3基因，用于AML患者CR后MRD的檢測。 我們用FLT3基因作為AML的分子標志，通過PCR技術跟蹤了AML完全緩解后的MRD，結果表明： 治療前FLT3陽性AML患者，經標準治療后，低于半數的患者達到完全緩解（CR），其中絕大部分患者FLT3基因表達減弱或轉為陰性；隨訪3-18個月，復發(fā)者FLT3基因表達轉為陽性，此結果表明FLT3基因表達與AML發(fā)病及疾病狀態(tài)有關，同時也反映出FLT3基因表達與MRD有關。FLT3基因表達陽性AML患者治療后，完全緩解(CR)率低于FLT3基因表達陰性的患者；另外FLT3基因表達陽性AML患者在緩解期仍可檢測出FLT3基因，且均于1年內復發(fā)，復發(fā)率顯著高于FLT3基因表達陰性患者,表明FLT3基因表達與預后有關。AML患者達CR后均需要鞏固強化治療,以消除MRD。AML患者達CR后FLT3基因表達持續(xù)陽性或轉陰后再次出現陽性，提示將發(fā)生復發(fā)，此結果表明FLT3基因能提前預示AML復發(fā)。 FLT3轉為陰性或長期持續(xù)陰性者預示能獲得長期無病生存。 所以,在完全緩解期追蹤檢測FLT3基因并分析其變化極為重要, 該基因持續(xù)陽性或由陰性變?yōu)殛栃?其復發(fā)的危險度是明顯增高的,這對及時調整化療方案、預防復發(fā)有著重要的臨床意義。【參考文獻】 1Kerst G, Kreyenberg H, Roth C, et al. 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