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精品論文不同類型苯硼酸改性的聚乙烯亞胺(pei)做為基因傳遞載體的研究鐘振林,陳富偈,卓仁禧5(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,生物醫(yī)用高分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072) 摘要:聚乙烯亞胺(polyethylenimine, pei)是最常見的應(yīng)用于基因載體的陽(yáng)離子聚合物。本文 設(shè)計(jì)、合成、表征了兩種分別帶有 o-胺甲基和 p-胺甲基苯硼酸基團(tuán)的 pei(pei1800-o-ba 和 pei1800-p-ba)。mtt 毒性測(cè)試結(jié)果表明這兩種 pei 衍生物的細(xì)胞毒性比 25 kda pei 小很 多。而且,兩種材料在不同細(xì)胞中的毒性表現(xiàn)不同,對(duì)于 hela 細(xì)胞,pei1800-p-ba 的毒性10比 pei1800-o-ba 小,pei1800-p-ba 濃度為 1mg/ml 時(shí)細(xì)胞存活率仍大于 50% ;而 pei1800-o-ba 的 ic50 約為 0.22mg/ml。相反地,對(duì)于 hepg2 細(xì)胞,pei1800-p-ba 的毒性 較 pei1800-o-ba 大,其 ic50 約為 0.22mg/ml,而 pei1800-o-ba 濃度為 1mg/ml 時(shí)細(xì)胞存 活率仍有 50%左右。熒光素酶基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明 pei-ba 是一種有效的非病毒基因傳遞載體, 其在 hepg2 和 hela 細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率皆比 25 kda pei 高。在表面富含 sialyl lewis x 糖15基的 hepg2 細(xì)胞中, pei1800-p-ba/dna 的轉(zhuǎn)染效率比 25 kda pei/dna 高約 5-10 倍;在 hela 細(xì)胞上 pei1800-o-ba 較 1800da pei 要高 2-3 個(gè)數(shù)量級(jí),在 n/p=10-20 時(shí)比 25kda pei 的轉(zhuǎn)染效率也要高出 5-10 倍。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)也顯示兩種材料在不同細(xì)胞上的基因傳遞效 果不同。這些結(jié)果表明苯硼酸對(duì)材料的轉(zhuǎn)染效率有著相當(dāng)重要的作用,而且不同類型苯硼酸 修飾的 pei 顯示出一定的細(xì)胞選擇性。20關(guān)鍵詞:高分子化學(xué)與物理;基因載體;聚乙烯亞胺;苯硼酸中圖分類號(hào):o633.2polyethylenimines (pei) modified with different types of phenylboronic acid groups for gene delivery25zhong zhenlin, chen fujie, zhuo renxi(college of chemistry & molecular science,key laboratory of bimedical polymers of ministryof education, wuhan university, wuhan 430072)abstract: polyethylenimine (pei) has been widely used for nonviral gene. in this paper, two derivatives (pei1800-o-ba and pei1800-p-ba) of pei1800 modified with different types of30phenylboronic acid groups were designed, synthesized, and investigated for use as gene vectors.pei1800-o-ba and pei1800-p-ba were prepared by the reaction of 1800da pei with4-(bromomethyl)phenylboronric acid and 2-(bromomethyl)phenylboronric acid, respectively. the two polymers could bind dna well when the n/p ratio was 1. they showed much lower cytoxicity than 25 kda pei. mtt assay indicated that pei1800-p-ba had lower cytoxicity than35pei1800-o-ba in hela cells, and higher cytoxicity in hepg2 cells. efficiency of the pei1800-o-ba and pei1800-p-ba as gene vectors was evaluated in vitro by transfection of pgl3 to hela and hepg2 cells. their efficiency was about one order of magnitude higher than that of25kda pei. the transfection efficiency of pei1800-o-ba was much higher than that ofpei1800-p-ba in hela cells but lower in hepg2 cells, showing a cell selectivity.40keywords: polymer chemistry and physics; gene vector; polyethylenimine; phenylboronic acid0引言隨著基因治療的興起,形形色色的材料應(yīng)用于基因傳遞載體。其中,聚乙烯亞胺(pei)及其衍生物無疑是最受關(guān)注的之一1-3。聚乙烯亞胺電荷密度高,易與帶負(fù)電的 dna 形成緊基金項(xiàng)目:高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(200804860030),國(guó)家自然科學(xué)基金(20974082)作者簡(jiǎn)介:鐘振林,男,教授,主要研究方向:生物可降解高分子,藥物控制釋放,基因載體。 e-mail:- 10 -45密的納米復(fù)合物,并通過靜電吸引與細(xì)胞膜結(jié)合,最后通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞4, 5。同時(shí), pei 還能夠起到保護(hù) dna 免受核酸酶降解的作用,產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)染效率6。但是,pei 仍有 其局限性,如電荷密度高,細(xì)胞毒性較大。一般來說,高分子量的 pei 具有高的轉(zhuǎn)染效率, 但它們的毒性也很大,而分子量較低的 pei 雖然沒有太大的細(xì)胞毒性,但是它的轉(zhuǎn)染效率也 不高。分子量低于 800da 的 pei 基本不能很好的復(fù)合 nda,也沒有好的轉(zhuǎn)染效果。因此,50通過對(duì)小分子 pei 進(jìn)行修飾來達(dá)到高效低毒的效果是許多研究組的研究課題,如:在低分子量 pei 間引入可降解化學(xué)鍵來制備交聯(lián)的 pei 7-12,可以形成相當(dāng)于高分子量 pei 的交聯(lián)產(chǎn) 物,能夠有效地負(fù)載和傳遞 dna,同時(shí)其可降解性也能保證其毒性小于高分子量 pei;在 低分子 pei 上引入疏水基團(tuán)形成兩親性陽(yáng)離子高聚物,在水中自組裝形成陽(yáng)離子膠束,能夠 有效地包裹 dna,并能有效地進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,毒性也相對(duì)較低13;此外,在 pei 分子上引55入靶向基團(tuán)也能提高轉(zhuǎn)染效果,彭琪等在 1.8 kda pei 上修飾 4-溴甲基苯硼酸后發(fā)現(xiàn),其轉(zhuǎn) 染效率比 1.8 kda pei 明顯提高 2-3 個(gè)數(shù)量級(jí),且毒性較小14。苯硼酸作為葡萄糖敏感和胰島素釋放的研究?jī)?nèi)容已經(jīng)被許多人所認(rèn)可。通過化學(xué)方法可 以將硼酸基團(tuán)連接到一些聚合物的側(cè)鏈上進(jìn)行改性15, 16。通常情況下,這些苯硼酸改性的 聚合物用來分析和檢測(cè)含有糖類物質(zhì)或是制備對(duì)葡萄糖敏感的凝膠17-20。近年來,作為重要60的糖靶向藥物在對(duì)細(xì)胞表面的糖蛋白識(shí)別的過程中起到了非常重要的作用21-24。苯硼酸是一 種路易斯酸,它能與糖基上的二醇可逆形成環(huán)狀酯而被廣泛地用作糖類的靶向和識(shí)別。有研 究表明苯硼酸與各種糖基分子的作用強(qiáng)度與苯硼酸的結(jié)構(gòu)及糖基的種類有很大的關(guān)系。同 時(shí),不同種類的細(xì)胞表面所含的糖基種類與數(shù)量也不盡相同,因此苯硼酸在細(xì)胞識(shí)別上也有 一定的應(yīng)用25,26。65本文通過在 pei 分子上分別修飾兩種不同類型苯硼酸基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)載體材料對(duì)細(xì)胞的靶 向性,從而表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染能力。同時(shí),還考察了不同的苯硼酸基團(tuán)對(duì)聚合物性質(zhì)的影響。 用凝膠電泳法研究這些聚合物與 dna 的相互作用,用光散射法表征聚合物和 dna 形成的 復(fù)合物大小及表面電荷情況,考察聚合物對(duì)細(xì)胞的毒性以及介導(dǎo) dna 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力,并 用共聚焦顯微法觀察了載體材料對(duì)細(xì)胞的靶向性。701實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑1800 da 和 25 kda pei 自 aldrich 公司購(gòu)得,直接使用。4-溴甲基苯硼酸和 2-溴甲基苯 硼酸自河北德隆泰公司購(gòu)得。pgl3 質(zhì)粒自 promega 公司購(gòu)得。yoyo-1 和 hoechst 33258 dye 購(gòu)于 molecular probes 公司。75人類肝癌細(xì)胞(hepg2)和人類子宮頸癌細(xì)胞(hela)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武 漢),dmem 培養(yǎng)基干粉購(gòu)自 gibco 。噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, mtt)購(gòu)自 amresco。二甲亞砜(dmso)購(gòu)自 sigma。細(xì)胞培養(yǎng)板和共聚 焦專用培養(yǎng)板購(gòu)自 nest,bca 蛋白檢測(cè)試劑盒和 gelred 染料分別購(gòu)自 pierce 和 biotium。1.2質(zhì)粒 dna 的提取和純化80pgl3 和 pegfp 質(zhì)粒分別是編碼螢光素酶和增強(qiáng)型熒光蛋白的基因,在本文中作為報(bào)告 基因系統(tǒng)。pgl3 在 jm109 大腸桿菌中轉(zhuǎn)化,而 pegfp 則在 dh5 大腸桿菌中轉(zhuǎn)化。兩種 菌都是在 lb 培養(yǎng)基中以 37,250 轉(zhuǎn)/分的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)來擴(kuò)增。質(zhì)粒的提取和純化是 通過去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化過程完成的。然后使用 te 緩沖溶液脫柱,并在20保存。質(zhì)粒通859095100105110115120過瓊脂糖凝膠電泳和紫外 260 nm、280 nm 的吸收比值來驗(yàn)證純度和產(chǎn)量。1.3苯硼酸修飾的 pei (pei1800-ba)的合成與表征將 1.80 g 1800 da pei (1.00 mmol)和 0.42 g 4-溴甲基苯硼酸 (0.21 mmol)溶于 15 ml 甲醇 中,該混合溶液在 70 oc 油浴下回流攪拌 24 h。冷卻到室溫后在乙醚中沉淀三次,真空干燥 后得到 1.63 g 淺黃色粘稠固體(pei1800-p-ba),產(chǎn)率為 74。1h nmr (300 mhz, d2o): 7.39 (d, 2h, arh), 7.11 (d, 2h, arh), 3.61-3.70 (m, 2h nch2ph), 2.662.47 (m, nch2ch2n andnch2ph)。同樣的方法,將 1.80 g 800 da pei (1.00 mmol)和 0.42 g 2-溴甲基苯硼酸 (0.21 mmol)溶于 15 ml 甲醇中,該混合溶液在 70 oc 油浴下回流攪拌 24 h。冷卻到室溫后用乙醚中沉淀 三次,真空干燥后得到 1.53 g 淺黃色粘稠固體(pei1800-o-ba),產(chǎn)率為 70%。1h nmr (300mhz, d2o): 7.25-7.02 (m, 4h, arh), 3.60-3.71 (m, 2h nch2ph),2.762.47 (m, nch2ch2n)。1.4pei1800-ba/dna 復(fù)合物的制備pei1800-ba/dna 復(fù)合物必須在實(shí)驗(yàn)前新制備。將 pei1800-ba 溶于 150 mm nacl 溶液中, 過濾除菌,制備成 1 mg/ml 的溶液。在 1.5 ml 無菌離心管中加入 2.2 l dna 的儲(chǔ)存液(460 ng/l)和適量已滅菌的 150 mm nacl 溶液,溶液調(diào)至 50 l。按照一定的 n/p 比,在溫和震 蕩下加入計(jì)算對(duì)應(yīng)量的 pei1800-ba 溶液,與質(zhì)粒 dna 混合,形成不同氮磷比(n/p)的 pei1800-ba/dna 復(fù)合物,渦旋震蕩 10 s,該復(fù)合物在室溫下靜置半小時(shí)后,用于凝膠電泳、 動(dòng)態(tài)光散射,激光共聚焦以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)。1.5瓊脂糖凝膠電泳將已制備的不同 n/p 比的 pei1800-ba 和 pgl3 形成的復(fù)合物,加入含有 2 l gelred 染 料的 0.7% 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn),按照 n/p 比分別為 0、0.5、1、2、4、6、8、10 加 樣。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)條件為恒壓 80 v,時(shí)間 80 min 后取出凝膠在凝膠成像儀(vilber lourmat) 下通過紫外照射成像觀察。1.6復(fù)合物粒徑和電位測(cè)定pei1800-ba 復(fù)合物的粒徑和電位均在 25時(shí)測(cè)定。取適量的聚合物溶液和 1 g pdna 制備不同 n/p 比的 pei1800-ba/dna 復(fù)合物?;靹蚝?,在室溫放置 30 min,然后將復(fù)合物溶 液用 150 mm nacl 溶液稀釋到 1 ml 來測(cè)定復(fù)合物的粒徑;用超純水稀釋到 1 ml 來測(cè)定復(fù) 合物的電勢(shì)。1.7細(xì)胞培養(yǎng)人類肝癌細(xì)胞 (hepg2) 和人類子宮頸癌細(xì)胞 (hela) 用含 10%胎牛血清 (fbs)、2 mg/ml nahco3 和 100 u/ml 雙抗(1%的青霉素-鏈霉素 10000 u/ml)的 dmem (gibco) 培養(yǎng) 基在 37 、5% co2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.8細(xì)胞存活率檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性用 mtt 法在人類子宮頸頸癌細(xì)胞 hela 細(xì)胞上進(jìn)行的。以約 5000 細(xì)胞/孔的密度在 96 孔培養(yǎng)板中接種 hela 細(xì)胞,并且每孔中加入 100 l 完全 dmem 培養(yǎng)基, 并將細(xì)胞在 5% co2 培養(yǎng)箱中于 37 培養(yǎng) 24 h。pei1800-ba 溶于完全 dmem 培養(yǎng)基,過濾 滅菌,用培養(yǎng)基將其等比例系列稀釋成不同濃度的高分子溶液。每孔細(xì)胞中加入 pei1800-ba 溶液 100 l(對(duì)照組直接加入 100 l dmem 培養(yǎng)基),每個(gè)高分子濃度做 4 個(gè)平行樣,對(duì)精品論文125130135140145150155照組做 8 個(gè)平行樣。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后,向所有孔中各加入 20 l mtt 的 pbs 溶液 (5 mg/ml),于 37 濕潤(rùn)環(huán)境中溫育 3.5 h。吸出孔中的培養(yǎng)基和過量 mtt,并各加入 150 l dmso 于 其中,并在室溫下輕柔振蕩,溶解紫色結(jié)晶甲瓚。用酶標(biāo)儀 (550 型 bio-rad) 在 570 nm 處 記錄吸光值。用酶標(biāo)儀測(cè)定 570 nm 處的吸收 od570nm。每個(gè)高分子濃度及對(duì)照組做 4 個(gè)平行 樣。以藥物濃度為橫坐標(biāo)(x 軸)、吸光值為縱坐標(biāo)(y 軸)繪制曲線圖。根據(jù)吸光值計(jì)算細(xì)胞 的相對(duì)存活率。空白組即不加細(xì)胞及聚合物溶液,對(duì)照組即不加聚合物溶液。細(xì)胞相對(duì)存活率(%) = 100(實(shí)驗(yàn)組 od-空白組 od)/(對(duì)照組 od-空白組 od)1.9基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)1.9.1熒光素酶檢測(cè)材料的熒光素酶基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是在 hepg2 和 hela 細(xì)胞上進(jìn)行的。細(xì)胞以 50,000-80,000 細(xì)胞/孔的密度在 24 孔培養(yǎng)板中接種,每孔中加入 1 ml 完全 dmem 培養(yǎng)基。待細(xì)胞在 co2 培養(yǎng)箱中于 37 下培養(yǎng) 24-36 h 至細(xì)胞覆蓋率約為 70時(shí),即可開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將適量的 聚合物溶液和 1 g pgl3 制備成不同 n/p 的復(fù)合物,用 150mm nacl 溶液稀釋至 100 l, 室溫下混勻并靜置 30 min。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前,先移去 24 孔板內(nèi)的培養(yǎng)基,并加入 900 l 新鮮無 血清的培養(yǎng)基,再將復(fù)合好的 100 l 復(fù)合物溶液加入到 24 孔板中,培養(yǎng) 4 h 后再次移去培 養(yǎng)基,換成 1 ml 新鮮完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后,移除培養(yǎng)基,用磷酸緩沖液 (pbs, 0.1m, ph7.4)輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞,最后在每孔中加入 200 l 裂解液 (promega) ,凍融三次并吹打以 充分裂解細(xì)胞。離心后,取 20 l 細(xì)胞裂解上清液與熒光素酶底物 (promega, 100 l) 充分 混合,在化學(xué)發(fā)光儀 (lumat lb9507, berthold) 上測(cè)定熒光素酶的活性。細(xì)胞裂解液中的蛋 白濃度由蛋白測(cè)定試劑 bca protein assay reagent kit (pierce) 測(cè)定,od 值在酶標(biāo)儀(bio-rad550)上 570 nm 讀取。每個(gè)樣品做 3 個(gè)平行樣測(cè)量取平均值,表示為平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。 細(xì)胞中表達(dá)的熒光素酶活性用 rlu/mg protein 表示。1.9.2激光共聚焦實(shí)驗(yàn)采用了激光共聚焦法觀察pei1800-ba/dna復(fù)合物對(duì)hepg2細(xì)胞的靶向性。hepg2細(xì)胞以1.5105細(xì)胞/孔的密度在共聚焦專用培養(yǎng)板中接種,每孔中加入2 ml完全dmem培養(yǎng)基,然 后把細(xì)胞在co2培養(yǎng)箱中于37 下培養(yǎng)1 d。在實(shí)驗(yàn)中,先將2 g dna和5 l 10 m yoyo-1 (molecular probes, u.s.a.) 在37 c培養(yǎng)箱中復(fù)合15 min,然后把pei1800-ba按照n/p為20的比 例加入yoyo-1標(biāo)記的質(zhì)粒dna中,同樣在37 培養(yǎng)箱中復(fù)合30 min,得到y(tǒng)oyo-1標(biāo)記的 pei1800-ba/pdna復(fù)合物。將該復(fù)合物加入細(xì)胞中,在無血清的dmem培養(yǎng)基中培育4 h,進(jìn) 行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后,培養(yǎng)板中的細(xì)胞用pbs洗三次,用4%多聚甲醛固定,再用20 l (2 mg/ml) hoechst 33258 dye (molecular probes, u.s.a.) 來標(biāo)記細(xì)胞核,37 ,15 min。細(xì)胞 再用pbs沖洗三次后在倒置相差顯微鏡(tes2000u, nikon, japan)下觀察并拍攝照片。2結(jié)果與討論2.1pei1800-ba 的設(shè)計(jì)及合成如式1所示,低分子量的1800 da pei分別與4-溴甲基苯硼酸和2-溴甲基苯硼酸反應(yīng),制 備苯硼酸改性的pei,即pei1800-p-ba和pei1800-o-ba。通過芐溴與胺的烷基化反應(yīng),將苯硼 酸接到小分子pei上。根據(jù)核磁計(jì)算,平均每個(gè)pei分子上分別接上了2.02(對(duì)位)和1.96(鄰 位)個(gè)苯硼酸,基本上能夠完全反應(yīng)。從式1可以看到,兩種苯硼酸接到pei上會(huì)有不同的結(jié)精品論文160構(gòu),鄰位的苯硼酸能和相鄰的n形成穩(wěn)定的五元環(huán)結(jié)構(gòu),也就是所謂的wullf型苯硼酸。一般而言,由于相鄰氮原子的配位作用,wullf型苯硼酸結(jié)合糖類化合物的能力更強(qiáng),并且適用 的酸堿環(huán)境也更寬。brh2n bnhoh bn ohh2nnh2nhoohpein nn-p-banh2oh bn n2nnh hbrbhoohh2n1800h nn nohho oh bnnh2nohbohpei1800-o-ba式 1 苯硼酸修飾的聚乙烯亞胺 pei1800ba 的制備165170175scheme 1 preparation of the phenylboronic acid modified pei (pei1800-ba)2.2pei1800-ba/pdna 復(fù)合物的制備及表征pei1800-ba/pdna的制備是通過將pei1800-ba溶液緩慢滴加到pdna的溶液中制成的。所 需pei1800-ba的量是由要測(cè)定的n/p比計(jì)算得來的,形成的復(fù)合物通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 和動(dòng)態(tài)光散射(dls)表征。如圖1 所示,隨著n/p 比的增加,材料結(jié)合dna 的能力越來越強(qiáng)。pei1800-p-ba 和 pei1800-o-ba分別在n/p為1時(shí)就能完全結(jié)合dna,使之不出孔。1800 da pei在n/p為4時(shí)才能 與dna形成穩(wěn)定的復(fù)合物4,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,這種苯硼酸改性的pei提高了結(jié)合dna的能力, 使其能在更低的n/p下有效結(jié)合dna。復(fù)合物的粒徑通過動(dòng)態(tài)光散射法(dls)在150 mm的nacl溶液中測(cè)定得到,其結(jié)果如圖2a所示。兩種苯硼酸改性的pei均能在n/p為10到30時(shí)與dna形成直徑約為350-450 nm的粒 子。兩種復(fù)合物的粒徑大小遠(yuǎn)小于1800 da pei/dna,稍大于25 kda pei/dna。180185圖 1 n/p 比為 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 時(shí) pdna 與 pei-p-ba (a), pei-o-ba (b)及 1800 da pei (c) 的復(fù)合物的凝膠電泳圖fig. 1 agarose gel electrophoresis of the pdna released from the polyplex with pei-p-ba (a), pei-o-ba (b),and 1800 da pei (c) at the n/p ratios of 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10. naked dna was used for comparison復(fù)合物的表面電勢(shì)是在純水中測(cè)定的,其結(jié)果如圖2b所示。兩種苯硼酸修飾的pei在n/p 大于15后,形成的dna復(fù)合物的表面電勢(shì)逐漸達(dá)到穩(wěn)定,均在20-30mv左右。這兩種復(fù)合物 的表面電勢(shì)處于1800 da pei/dna與25 kda pei/dna之間。其中, pei1800-o-ba與dna形成 的復(fù)合物表面電勢(shì)要略小于pei1800-p-ba /dna復(fù)合物。這可能與苯硼酸上的b能與pei上的n 形成穩(wěn)定的五元環(huán)配位結(jié)構(gòu),減少了可質(zhì)子化的n元素,因而降低了表面電勢(shì)有關(guān)。a140012001000800size (nm)6004002000pei-o-ba2pei-p-ba21800 da pei25 kda pei0 5 10 15 20 2530n/p ratios55b 504540zeta potential (mv)35302520151050-5pei-o-bapei-p-ba1800 da pei25 kda pei0 10 2030n/p ratios190195圖 2. pei-ba/pdna 復(fù)合物在 150 mm nacl 溶液中的粒徑(a)以及在水中的表面電勢(shì)(b) fig 2. size (a) and surface charge (b) of pei-ba/pdna polyplexes in 150 mm nacl solution and water, respectively2.3pei1800-ba 的細(xì)胞毒性采用 mtt 法在 hela 和 hepg2 細(xì)胞上測(cè)定 pei1800-ba 的細(xì)胞毒性。 圖 3 顯示,pei1800-ba 系列產(chǎn)物在兩種細(xì)胞上的毒性均比 25 kda pei 低得多,但較 1800 da pei 高。圖3a 顯示 pei1800-p-ba 在 hela 細(xì)胞上表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性比 pei1800-o-ba 小,在濃度為 1mg/ml 時(shí)細(xì)胞存活率仍大于 50%,而 pei1800-o-ba 的 ic50 約為 0.22mg/ml。圖 3b 顯示 pei1800-p-ba 在 hepg2 細(xì)胞上的 ic50 約為 0.22mg/ml;而 pei1800-o-ba 在濃度在 1mg/ml 時(shí)細(xì)胞存活率200仍有 50%左右,但是在低濃度區(qū) pei1800-o-ba 的毒性更大。在 hela 細(xì)胞上的毒性結(jié)果表明,pei1800-o-ba 由于其能形成 wullf 型苯硼酸的結(jié)構(gòu),大 大增強(qiáng)了其與細(xì)胞表面糖基的作用,從而影響細(xì)胞的正常生理代謝,增加了細(xì)胞毒性;而 pei1800-p-ba 不能形成穩(wěn)定的五元環(huán)狀結(jié)構(gòu),在生理?xiàng)l件下與細(xì)胞表面糖基的結(jié)合能力較弱。a1.21.00.80.6relative cell viability0.40.2pei-p-ba pei-o-ba1800 da pei25 kda pei0.00.81.01.2concentration of polymer (mg/ml)b 1.11.0relative cell viability0.30.2pei-p-ba pei-o-ba1800 da pei25 kda pei0.00.81.01.2concentration of polymer(mg/ml)205210215220225230圖 3 加入 pei-ba, 1800 da pei 和 25 kda pei 后 24 小時(shí)用 mtt 法測(cè)得的 hela (a)和 hepg2 (b)細(xì)胞的相 對(duì)存活率fig. 3 relative cell viability of hela (a) and hepg2 (b) cells at 24 h after addition of pei-ba, 1800 da pei, and25 kda pei as demonstrated by mtt assay根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,hepg2 細(xì)胞表面有一種叫唾液酸化的路易斯抗原 (sialyl lewis x)的 寡聚糖。這種寡聚糖大量存在于肝癌、胃癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌以及膀胱癌細(xì)胞表 面,并與其腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有著密切的關(guān)系。sialyl lewis x 由唾液 酸、半乳糖、巖藻糖和 n-乙?;咸烟墙M成。分子式為 -neunac-(23) - d-gal- (14) (-l-fuc-13)- d-glcnac。在 sialyl lewis x 分子中有 11 個(gè)羥基,大都是 cis-1,2 或 1,3 的 雙羥基形式存在。許多研究也表明,sialyl lewis x 與苯硼酸有相當(dāng)好的結(jié)合能力25-26。在 hepg2 細(xì)胞上的毒性結(jié)果表明,pei1800-p-ba 能夠與細(xì)胞表面的 sialyl lewis x 的寡聚糖的 作用從而影響細(xì)胞的正常生理代謝導(dǎo)致其毒性增大,而 pei1800-o-ba 在高濃度時(shí)的毒性反而 比 pei1800-p-ba 小有些出乎意料。2.4pei1800-ba 為載體的體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)pei1800-ba 的體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)通過介導(dǎo) pgl3 在 hepg2 和 hela 細(xì)胞上測(cè)定,以 25kda pei 在 n/p 為 10 時(shí)作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率的參照物。pei1800-ba 在 hepg2 和 hela 細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率如圖 4 所示。對(duì)于 hela 細(xì)胞而言, pei1800-p-ba 在低 n/p 時(shí)比 1800 da pei 高,但當(dāng) n/p 升高時(shí),pei1800-p-ba 與 1800 da pei 基本相當(dāng)。而 pei1800-o-ba 比 1800 da pei 要高出 2-4 個(gè)數(shù)量級(jí),在 n/p=15-25 時(shí)比參照的25 kda pei 在 n/p 為 10 的轉(zhuǎn)染效率也要高出 5-10 倍。對(duì)于 hepg2 細(xì)胞而言,結(jié)果完全不 同,pei1800-p-ba 顯示出相當(dāng)好的轉(zhuǎn)染效果,比 1800 da pei 要高出 2-3 個(gè)數(shù)量級(jí),在 n/p 為 20-30 時(shí)比參照的 25 kda pei 在 n/p 為 10 的轉(zhuǎn)染效率也要高出 2-5 倍。而 pei1800-o-ba 的表現(xiàn)雖然好于 1800 da pei,且在低 n/p 比時(shí)比 pei1800-p-ba 轉(zhuǎn)染效率高,但在高 n/p 比 時(shí)不如 pei1800-p-ba。這個(gè)結(jié)果與前面的毒性測(cè)試有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在 hepg2 細(xì)胞表面有一種叫 sialyl lewis x 的寡聚糖,這種寡聚糖與苯硼酸有相當(dāng)好的 結(jié)合能力25-26,而在 hela 細(xì)胞上幾乎沒有這種寡聚糖。pei1800-p-ba 的轉(zhuǎn)染效果顯示,其 在有豐富 sialyl lewis x 寡聚糖的 hepg 2 細(xì)胞上有相當(dāng)好的轉(zhuǎn)染效果,而在 hela 細(xì)胞上表 現(xiàn)不佳。上述結(jié)果表明,苯硼酸在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中起到了比較關(guān)鍵的作用, 并且對(duì)細(xì)胞種類表現(xiàn)出一定的選擇性。hela10101800 da peipei-o-pb pei-p-pb 25 kda peihepg21081800 da pei pei-o-pbpei-p-pb 25 kda peirlu/mg protein109rlu/mg protein10710810710610610510510152025301015202530n/p ration/p ratio104235240245250255圖 4 pgl3 與 pei-pb 的復(fù)合物在 hela 和 hepg2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(以 25kda pei 為參照) fig. 4 in vitro transfection efficiency of the polyplexes of pgl3 with pei-pb in hela and hepg2 cells in comparison with 25 kda pei而 pei1800-o-ba 在兩種細(xì)胞上都表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效果,均比未修飾苯硼酸的 1800 da pei 高。這是因?yàn)?pei1800-o-ba 中的苯硼酸由于在苯環(huán)鄰位上的甲氨基可與苯硼酸形成配位 鍵而成為五元環(huán)的 wullf 型苯硼酸結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)報(bào)道,wullf 型苯硼酸在生理?xiàng)l件下對(duì)大多數(shù) 糖類分子都表現(xiàn)出較一般苯硼酸更高的結(jié)合能力。因此,pei1800-o-ba 在 hela 細(xì)胞上表現(xiàn) 出極為優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效果。比較兩種材料在兩種細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),可以得出以下結(jié)論:苯硼酸與細(xì)胞的相互作用 是提高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。同時(shí),pei 所帶的正電荷仍然起到很大的作用,兩種作用起到了協(xié) 同作用。在低 n/p 比時(shí),由于苯硼酸修飾的 pei 提高了與 dna 的結(jié)合能力從而使轉(zhuǎn)染效果 提高;在高 n/p 比時(shí),pei1800-o-ba 在 hepg2 細(xì)胞上轉(zhuǎn)染效果不如 pei1800-p-ba,其原因有 待進(jìn)一步探討。圖 5 在 pei-o-ba/pdna 復(fù)合物 (a)和 pei-p-ba/pdna 復(fù)合物(b)存在下培養(yǎng)的 hepg2 和 hela 細(xì)胞的激 光共聚焦顯微照片。左: h33258 標(biāo)記的細(xì)胞核(藍(lán)色);中: yoyo-1 標(biāo)記的 dna(綠色);右:疊加圖 fig5confocal microscopy images of hepg2 and hela cells incubated with pei-o-ba/pdna polyplexes (a) and pei-p-ba/pdna polyplexes (b). left: h33258 labeled nucleus (blue);middle: yoyo-1 labeled dna (green); right:overlapped.260為考察 pei1800-ba/pgl3 對(duì)細(xì)胞的靶向性,用激光共聚焦顯微鏡觀察了 pei1800-ba 在hepg2 和 hela 細(xì)胞上的細(xì)胞吞噬情況(圖 5)。結(jié)果表明:兩種材料均能有效地?cái)y帶質(zhì)粒 dna 進(jìn)入細(xì)胞,并且能有效地傳遞到細(xì)胞核。對(duì) hepg2 細(xì)胞而言,pei1800-p-ba 比 pei1800-o-ba 更好;而對(duì) hela 細(xì)胞而言,pei1800-o-ba 更好。這樣的結(jié)果與前面的轉(zhuǎn)染結(jié)果類似。綜合 毒性、體外轉(zhuǎn)染和共聚焦結(jié)果,苯硼酸提高材料的轉(zhuǎn)染效果與其能否有效的結(jié)合細(xì)胞表面糖精品論文265270275基有密切關(guān)系。當(dāng)苯硼酸能有效結(jié)合細(xì)胞表面糖基時(shí),其轉(zhuǎn)染效率增高,細(xì)胞吞噬增強(qiáng),同時(shí),由于影響了細(xì)胞的正常生理代謝,毒性增大。反之,苯硼酸不能有效結(jié)合糖基時(shí),轉(zhuǎn)染 效率不增高,細(xì)胞吞噬不強(qiáng),毒性也低。3結(jié)論本文成功合成了用兩種不同類型苯硼酸修飾的低分子量聚乙烯亞胺 pei1800-o-ba 和 pei1800-p-ba。兩種陽(yáng)離子聚合物均能與 dna 有效結(jié)合,在 n/p 比為 1 時(shí)就可完全阻滯 dna 的遷移。pei1800-o-ba 和 pei1800-p-ba 與 dna 形成的復(fù)合物粒徑介于 1800 da pei 與 25 kda pei 的復(fù)合物之間,約為 350-450nm,其表面電勢(shì)在 n/p 比超過 15 時(shí)達(dá)到穩(wěn)定,約為 20-30mv, 同樣處于 1800 da pei 與 25 kda pei 之間。另外,pei1800-o-ba2/dna 復(fù)合物的表面電勢(shì)較 pei1800-p-ba2/dna 復(fù)合物略低。兩種材料在不同細(xì)胞中表現(xiàn)的毒性不盡相同,但毒性均遠(yuǎn) 遠(yuǎn)小于 25 kda pei,并表現(xiàn)出一定的細(xì)胞選擇性。基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種材料均能 有效介導(dǎo) pgl3 轉(zhuǎn)染 hepg2 和 hela 細(xì)胞,苯硼酸的引入提高了 pei 的轉(zhuǎn)染效率。由于苯硼 酸種類的不同帶來的結(jié)構(gòu)上的變化,兩種材料對(duì)不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果也不盡相同,對(duì)特定細(xì) 胞表現(xiàn)出一定的選擇性。參考文獻(xiàn) (references)2802852902953003053103151 urban j h and merten c a. retroviral display in gene therapy, protein engineering, and vaccinedevelopment j. acs chem. biol. 2011, 6: 61-74.2 chen m, zhang x q, man h b, et al., nanodiamond vectors functionalized with polyethylenimine for sirna delivery j. j. phys. chem. lett. 2010, 1: 3167-3171.3 gustafson j a, price r a, greish k, et al., silk-elastin-like hydrogel improves the safety ofadenovirus-mediated gene-directed enzymeprodrug therapy j. mol. pharmaceutics 2010, 7:1050-1056.4 haisma h j and bellu a r. pharmacological interventions for improving adenovirus usage in gene therapyj. mol. pharmaceutics 2011, 8: 50-55.5 de laporte l, 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