生物化學(xué)第9章酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué).ppt

第9章 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),一、化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ) 二、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響 三、酶的抑制作用 四、溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響 五、pH對(duì)酶反應(yīng)的影響 六、激活劑對(duì)酶反應(yīng)的影響,(kinetics of enzyme-catalyzed reaction),研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的意義,酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率以及影響此速率的各種因素的科學(xué)。在研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及酶的作用機(jī)制時(shí)，需要?jiǎng)恿W(xué)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)；為發(fā)揮酶催化反應(yīng)的高效率，尋找最有利的反應(yīng)條件；為了解酶在代謝中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等，都需要掌握酶促反應(yīng)速率的規(guī)律。,二、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響,酶反應(yīng)速率對(duì)底物濃度作圖,中間復(fù)合物學(xué)說,為了解釋這個(gè)現(xiàn)象，Henri和Wurtz提出了酶底物復(fù)合物學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為，當(dāng)酶催化反應(yīng)時(shí)，酶首先與底物結(jié)合，生成酶底物復(fù)合物，然后生成產(chǎn)物，并釋放出酶。反應(yīng)用下式表示： S + E ES P + E,酶底物中間復(fù)合物存在的證據(jù),電子顯微鏡和X光衍射直接觀察到酶與底物的復(fù)合物。 酶與底物結(jié)合后光譜發(fā)生變化。 溶解度或熱穩(wěn)定性在加入底物后發(fā)生變化。 分離到了酶底物復(fù)合物。 超離心沉降過程中，可觀察到酶和底物共沉降的現(xiàn)象。 平衡透析時(shí)，觀察到底物在半透膜兩側(cè)濃度不相同(半透膜的一側(cè)有酶，另一側(cè)無(wú)酶，有酶一側(cè)底物濃度高于無(wú)酶一側(cè))。,（1）平衡學(xué)說,（Henri，Michaelis和Menten方程）,1902年Henri和Brown提出了酶催化的反應(yīng)機(jī)理 1913年Michaelis和Menten完善了這個(gè)理論，他們認(rèn)為酶反應(yīng)的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，為限速反應(yīng)。,平衡學(xué)說推導(dǎo)反應(yīng)速度方程的假設(shè)前提,在推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程時(shí)，有幾點(diǎn)假設(shè)： 第一步迅速平衡，第二步慢，即 k3 E，S ES。 酶以E和ES兩種狀態(tài)存在。,根據(jù)平衡學(xué)說推導(dǎo)速度方程,設(shè)Vf 為E與S結(jié)合的速度，Vr 為ES解離的速度，則Vfk 1 ( E0ES )( SES ) Vrk 2 ES 平衡時(shí)VfVr k 1 ( E0ES )( SES ) k 2 ES 又 S ES SESS,根據(jù)平衡學(xué)說推導(dǎo)速度方程,k1 ( E0ES ) S k 2 ES 解出 ES 得,令 ， 則,根據(jù)平衡學(xué)說推導(dǎo)速度方程,由于V = k 3 ES，代入前式 得 因?yàn)楫?dāng)所有的E都成為ES時(shí)，可達(dá)最大反應(yīng)速度，即Vm = k 3 E0 ，所以 這就是米氏方程。,米氏方程,米氏方程是一個(gè)雙曲線方程，若以S為自變量，V為因變量，可以作出雙曲線，與實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果相符。,（2）穩(wěn)態(tài)理論,1925年，Briggs和Haldane提出了穩(wěn)態(tài)（steady state）理論，對(duì)米氏方程做了一項(xiàng)很重要的修正： 在 反應(yīng)式中，k3值不小，后一步驟不是限速步驟。 所謂穩(wěn)態(tài)是指反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，系統(tǒng)中的酶底物復(fù)合物濃度由零逐漸增加到一定數(shù)值，然后保持不變，即處于穩(wěn)態(tài)水平，此時(shí)ES的解離和分解速率之和等于ES的形成速率，,根據(jù)穩(wěn)態(tài)學(xué)說推導(dǎo)速度方程,產(chǎn)生ES的速率 消耗ES的速率 穩(wěn)態(tài)時(shí) 所以,根據(jù)穩(wěn)態(tài)學(xué)說推導(dǎo)速度方程,移項(xiàng)得,令 ，代入上式得,將上式中的ES解出得,此ES即為穩(wěn)態(tài)時(shí)的復(fù)合物濃度。,根據(jù)穩(wěn)態(tài)學(xué)說推導(dǎo)速度方程,因?yàn)槊阜磻?yīng)速率與ES成正比，即 所以,又因?yàn)楫?dāng)所有的酶都與底物結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)到最大，即 ，代入上式得,（穩(wěn)態(tài)法）,（快速平衡法）,兩個(gè)米氏方程的區(qū)別,這兩個(gè)方程的區(qū)別就在于快速平衡法推導(dǎo)的方程中米氏常數(shù)是Ks，而穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)的米氏方程中米氏常數(shù)是Km。,Ks是ES的解離平衡常數(shù),米氏方程的幾個(gè)特點(diǎn),從米氏方程中可以看出： 當(dāng)S Km時(shí)， ，反應(yīng)速率達(dá)到最大，并與底物濃度無(wú)關(guān)，屬零級(jí)反應(yīng)； 當(dāng)S = Km時(shí)， ，所以，Km的意義是使反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度。,米氏方程曲線,米氏常數(shù)的意義, Km是酶的特征性常數(shù)，其單位是濃度單位。在一定的反應(yīng)條件下，對(duì)于一定的底物，Km是定值。 Km可以判斷酶的天然底物。有些酶可以作用于幾個(gè)底物，其中Km最小的底物是天然底物。 當(dāng)k3 k2時(shí)，Km = Ks，可以作為判斷酶與底物親和力的指標(biāo)，Km越小，酶與底物的親和力越大。 根據(jù)Km值，可以計(jì)算出在某一底物濃度下，反應(yīng)速率是最大反應(yīng)速率的百分之多少。 根據(jù)細(xì)胞內(nèi)酶反應(yīng)正反兩方面的底物濃度，以及兩方面的Km值，可以推測(cè)細(xì)胞內(nèi)代謝的方向。,米氏方程S與 V / Vm 的關(guān)系,當(dāng)S=10Km時(shí)，V=0.91Vm 當(dāng)S=0.1Km時(shí)，V=0.091Vm 反之，可以計(jì)算出要達(dá)到一定的最大反應(yīng)速率的分?jǐn)?shù)，需要加多少底物。 （見P360表9-2）,Vm和k3的意義,在一定的反應(yīng)條件下，Vm與酶濃度成正比。當(dāng)SKm時(shí)，V = Vm = k3E0，此時(shí)對(duì)底物來(lái)說是零級(jí)反應(yīng)，對(duì)酶來(lái)說是一級(jí)反應(yīng)，k3是一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)，k3表示當(dāng)酶被底物飽和時(shí)每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)（又稱為轉(zhuǎn)換數(shù)），這時(shí)的k3又可以寫成 kcat，kcat 越大，說明酶的催化效率越高。,kcat /Km的意義,Kcat /Km表示酶的催化效率，Kcat /Km越大，催化效率越高。 ，其最大值極限是k1，而k1是酶與底物結(jié)合的速率常數(shù)，此常數(shù)受到底物在溶液中擴(kuò)散速度的影響。,作圖法求Km和Vm值 （Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法）,將米氏方程兩邊取倒數(shù)得 在一系列S下測(cè)出相應(yīng)的反應(yīng)速率v，以 對(duì) 作圖，可得出Km和Vm值。,米氏方程的雙倒數(shù)圖,多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),（酶促反應(yīng)按底物分子數(shù)的分類）,多底物反應(yīng)按動(dòng)力學(xué)機(jī)制分類 （序列反應(yīng)）,底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放有一定的順序： E+A+BEABEPQE+P+Q 產(chǎn)物不能在兩種底物都結(jié)合之前釋放。這類反應(yīng)又可以分為兩種類型。,有序反應(yīng) （ordered reaction）,其中P是B轉(zhuǎn)變的產(chǎn)物，Q是A轉(zhuǎn)變的產(chǎn)物。 如脫氫酶的輔酶NAD(P)+相當(dāng)于A，NAD(P)H相當(dāng)于Q。,隨機(jī)反應(yīng) （random reaction）,如肌酸激酶催化肌酸與ATP反應(yīng)生成磷酸肌酸和ADP。,乒乓反應(yīng) （ping pong reaction）,如轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)： 氨基酸1 酮酸2 酮酸1 氨基酸2,A B P Q,三、酶的抑制作用,因酶蛋白變性而酶活力喪失稱為酶的失活作用，而因?yàn)槟撤N物質(zhì)與酶結(jié)合使酶活力喪失稱為酶的抑制作用，酶受抑制喪失活力時(shí)酶蛋白并沒有變性。能抑制酶活力的物質(zhì)稱為酶的抑制劑（inhibitor）。 研究酶的抑制作用是研究酶的結(jié)構(gòu)和功能、酶的催化機(jī)制，以及闡明代謝途徑的基本手段，也可以為醫(yī)藥設(shè)計(jì)新藥物和為新農(nóng)藥的研制提供理論依據(jù)。,抑制程度的表示方法,（1）相對(duì)活力分?jǐn)?shù)（殘余活力分?jǐn)?shù)） （2）相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)（殘余活力百分?jǐn)?shù)） （3）抑制分?jǐn)?shù)（被抑制而失去活力的分?jǐn)?shù)） （4）抑制百分?jǐn)?shù),抑制作用的類型,1不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制劑與酶活性中心的基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，不能用透析、超濾、凝膠過濾等物理方法去除。 2可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制劑與酶活性中心的基團(tuán)以非共價(jià)鍵結(jié)合，可以用透析、超濾、凝膠過濾等物理方法去除而使酶恢復(fù)活力。,可逆抑制作用的3種類型,（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制（competitive inhibition） I 和 S 競(jìng)爭(zhēng)與酶的活性中心結(jié)合，二者只能結(jié)合一個(gè)。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常是底物類似物，它可以與酶結(jié)合，但不能被