儀器分析-高效液相色譜法.ppt

第20章 高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC),20.1.1 高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展,高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，導致高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的產(chǎn)生。,薄殼型填料，柱效僅每米10003000塔板數(shù),510m球型和無定型微粒硅膠，每米56萬理論塔板數(shù),鍵合相色譜、離子色譜、疏水色譜、親和色譜、手性色譜、脂質(zhì)體色譜、生物膜色譜、整體柱色譜、微徑柱和毛細管柱色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等,20.1.1 高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展,高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，導致高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的產(chǎn)生。,薄殼型填料，柱效僅每米10003000塔板數(shù),510m球型和無定型微粒硅膠，每米56萬理論塔板數(shù),高度均勻甚至單分散13m硅膠基質(zhì)球形填料，達1530萬理論塔板/m。,新型分離模式和方法不斷增加,20.1.1 高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展,高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，導致高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的產(chǎn)生。,薄殼型填料，柱效僅每米10003000塔板數(shù),510m球型和無定型微粒硅膠，每米56萬理論塔板數(shù),高度均勻甚至單分散13m硅膠基質(zhì)球形填料，達1530萬理論塔板/m。,新型分離模式和方法不斷增加,基本特點 1. 高效、高速、高靈敏度 2. 填料粒徑和流動相性質(zhì)影響色譜柱效 3局限性 操作條件 1. 流動相對分離選擇性的影響 2. 柱外效應 3. 操作壓力 適用范圍廣,20.1.2.高效液相色譜法的特點及與其他色譜法比較,1. 吸附色譜(adsorption Chromatography) 2. 分配色譜(partition Chromatography) 3. 離子交換色譜(ion-Exchange Chromatography) 4. 體積排阻色譜(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作用的主要保留機理，但可能還存在次要的其他機理。,20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系,根據(jù)固定相和液體流動相相對極性的差別，有正相色譜和反相色譜兩種色譜體系或方法。 反相色譜和正相色譜主要區(qū)別是流動相和固定相的相對極性，最初形成于液液分配色譜，現(xiàn)已廣泛應用于其他各種色譜方法。,上述每種色譜類型均可進一步分為多個不同色譜方法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各色譜方法在相關領域應用互相補充。,20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系,現(xiàn)代高效液相色譜使用310m柱填料，為達到適用的流動相流速，高壓泵需提供幾十MPa或數(shù)百大氣壓力的柱前壓。因而HPLC儀器比其他類型的色譜儀要復雜和昂貴。,20.2. 高效液相色譜儀,1,2,3,-流動相溶劑儲器；4,5,6,-過濾器；7溶劑比例調(diào)節(jié)閥和混合室；8輸液泵；9脈動阻尼器；10放空閥；11過濾器；12反壓控制器；13進樣閥；14色譜柱；15檢測器。,20.2. 高效液相色譜儀,現(xiàn)代高效液相色譜儀配備一或多個流動相儲液器，一般為玻璃瓶，亦可為耐腐蝕的不銹鋼、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特種塑料制成的容器。每個儲瓶容積5002000mL。儲液瓶位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差，在泵啟動時易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過放空閥排出。 儲器常裝有脫除溶劑中溶解的氧、氮等氣體裝置，這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬，并干擾檢測器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法，其一是攪拌下真空或超聲波脫氣；另一種是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲液器的溶劑導管入口處裝有過濾器，以進一步除去溶劑中灰塵或微粒殘渣，防止損壞泵、進樣閥或堵塞色譜柱。,20.2.1.流動相貯器和溶劑處理系統(tǒng),通用HPLC儀輸液泵系統(tǒng)的基本要求是：提供(50-500)105Pa的柱前液壓；輸出無脈動恒定的液流；流速范圍0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系統(tǒng)組件耐腐蝕(密封性良好的不銹鋼或氟塑料)。高壓泵產(chǎn)生的液體高壓沒有爆炸危險，因為液體的壓縮性極小。最重要的是系統(tǒng)密封性能好。 目前常使用的有三種類型的輸液泵，即往復柱塞泵、氣動放大泵、螺旋注射泵，它們各有優(yōu)、缺點。 1.往復柱塞泵,20.2.2.高壓泵系統(tǒng),1.電機，2.往復凸輪，3.密封柱塞，4.吸排液單向閥，5.溶劑入口，6.脈動阻尼器,7.接色譜柱。,2. 其他類型泵 氣動放大泵又稱為恒壓泵，其工作原理與水壓機相似，以低壓氣體作用在大面積氣缸活塞上，壓力傳遞到小面積液缸活塞，利用壓力放大獲得高壓。 螺旋注射泵又稱為排代泵，其結構類似于醫(yī)用注射器，由一個大體積液體室和柱塞組成，步進電機通過螺旋桿傳動機構推動柱塞輸出高壓液體。 3.流速控制和程序系統(tǒng) 比例調(diào)節(jié)閥和混合器；脈動阻尼器；放空閥；過濾器；反壓控制傳感器等。,20.2.2.高壓泵系統(tǒng),高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。,進樣閥,20.2.3.進樣系統(tǒng),動 畫,色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達25mm 以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。,20.2.4.高效液相色譜柱,1.色譜柱類型,按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細管柱四種類型。,20.2.4.高效液相色譜柱,2.保護柱,一般在分析柱前裝上較短的保護柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結合的組分，以保護較昂貴的分析柱，延長使用壽命。,3.柱恒溫器,對色譜柱嚴格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。,4. 柱填充技術,根據(jù)填料粒徑大小采用干法或濕法裝柱。粒徑大于20m，采用類似氣相色譜的干法裝柱，實際上這種方法己很少使用。 目前大多數(shù)采用10m以下填料，以稱為等密度勻漿濕法裝柱。,20.2.4.高效液相色譜柱,注:1.高壓泵，2.壓力表，3.排空氣閥，4.勻漿罐，5.色譜柱，6.加壓介質(zhì)瓶，7.廢液杯。,在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等?，F(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:,20.2.5.液相色譜檢測器,l. 光吸收檢測器：紫外吸收檢測器，光二極管陣列檢測器，紅外吸收檢測器 2. 熒光檢測器 3. 示差折光率檢測器 4. 蒸發(fā)光散射檢測器 5. 電化學檢測器,20.2.5.液相色譜檢測器,1. 紫外吸收(UV) 檢測器 應用最廣，對大部分有機化合物有響應。 特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。,20.2.5.1.光吸收檢測器,2.紫外光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,20.2.5.1.光吸收檢測器,20.2.5.1.光吸收檢測器,2.紫外光電二極管陣列檢測器,20.2.5.1.光吸收檢測器,2.紫外光電二極管陣列檢測器,紫外普通檢測器和光電二極管陣列檢測器的比較,普通檢測器,光電二極管陣列檢測器,3. 紅外吸收檢測器 與一般光吸收檢測器光路設計相似，其吸收池窗口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過吸收池的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測器可提供分子結構信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動相溶劑都有紅外吸收及窗口材料限制，其應用有限。,20.2.5.1.光吸收檢測器,高靈敏度、高選擇性 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應.,20.2.5.2. 熒光檢測器(Fluorescence Detector，F(xiàn)D),除紫外檢測器之外應用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；,通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；,20.2.5.3. 示差折光檢測器（Differential Refrative Index Detector, RI）,示差折光檢測器光路,20.2.5.3. 示差折光檢測器（Differential Refrative Index Detector, RI）,20.2.5.4. 蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporation Light Scattering Detector, ELSD),1.色譜柱出口; 2.液壓釋放口; 3.氮氣入口; 4.霧化器; 5.加熱漂移管; 6.樣品液滴; 7.激光光源; 8.排氣口; 9.光電檢測器; 10.放大器; 11.連接記錄系統(tǒng)。 A.色譜柱洗出液霧化區(qū)；B.溶劑蒸發(fā)區(qū);C.樣品粒子光散射。,20.2.5.5. 電化學檢測器,基于電化學原理和物質(zhì)的電化學性質(zhì)進行檢測，主要有安培、極譜及電導等幾種類型，適用于測定具有電化學氧化還原性質(zhì)及電導的化合物，如含硝基、氨基等有機化合物及無機陰、陽離子等。,1.氟塑料池體,2.工作電極,3.氟塑料或聚酯墊片,4.接參比電極，至廢液，5.接色譜柱。,20.3.1. 高效液相色譜固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。,20.3.高效液相色譜固定相和流動相,由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是： 1.化學惰性，不與固定相和被分離組分發(fā)生化學反應，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。 2.適用的物理性質(zhì)，包括沸點較低，以便于分離組分和溶劑回收;低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無紫外吸收等，以降低UV檢測器本低響應，提高檢測靈敏度;對樣品具有適當溶解能力等。 3.溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價廉等，便于操作和安全。,20.3.2. 液相色譜流動相,1.溶劑強度參數(shù)0 定義為溶劑分子在單位吸附劑表面積上的吸附自由能，表征溶劑分子對吸附劑的親和力大小。 2.溶解度參數(shù) 它是溶劑與溶質(zhì)分子間各種作用力的總和，包括色散力、偶極作用力、接受質(zhì)子能力、給于質(zhì)子能力等。 3.極性參數(shù)P 表示每種溶劑與乙醇、二氧六環(huán)和硝基甲烷三種極性物質(zhì)相互作用力的度量，類似于氣相色譜固定液的Rohrschneider常數(shù)，反映溶劑接受質(zhì)子、給出質(zhì)子和偶極相互作用能力及選擇性差異，亦作為表征溶劑洗脫強度的指標。,20.3.2. 液相色譜流動相,20.3.2. 液相色譜流動相,20.3.2. 液相色譜流動相,優(yōu)化保留值k和分離選擇性的重要方法是改變流動相溶劑類型和組成。 溶劑組成優(yōu)化用差試法比較麻煩、費時，成功率不一定很高。采用溶劑組成與溶劑強度參數(shù)關系的估算,可減少優(yōu)化實驗操作。二元混合溶劑極性參數(shù)P與其體積組成呈線性關系，可按算數(shù)平均值求出。例如溶劑A和B混合物的極性參數(shù)PAB可按下式求出: 對極性吸附和正相色譜: 對于反相色譜:,20.4.吸附色譜(Adsorption Chromatography),20.4.1.液固吸附色譜固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。,20.4.吸附色譜(Adsorption Chromatography),20.4.1.液固吸附色譜固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小。孔穴淺的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。,當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附:,20.4.2吸附色譜分離機理,液固色譜一般較少考慮吸附劑類型。 常采用薄層色譜技術進行初步探索。 吸附劑含水量是控制吸附劑活性，影響溶質(zhì)保留的重要因素。,20.4.3.分離條件優(yōu)化和應用,研究最多、應用最廣泛的高效液相色譜類型。 可分為液-液色譜和化學鍵合相色譜。前者是早期主要分配色譜類型，以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，即化學鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面。 化學鍵合相色譜巳成為占絕對優(yōu)勢的分配色譜類型。,20.5.分配色譜(Partition Chromatography),液液色譜固定相是將極性或非極性固定液涂漬在全多孔或薄殼型硅膠等載體表面形成的液膜。要求載體表面惰性，比表面積約50250m2/g，比表面積不宜太高，以降低殘余吸附效應。 固定液涂漬在載體上有兩種方法：一種是靜態(tài)法，以固定液溶液浸漬載體，然后用緩慢地蒸發(fā)除去溶劑；另一種是在位動態(tài)涂漬法，將載體填充在色譜柱中，然在將一定固定液濃度的流動相連續(xù)流經(jīng)色譜柱，至固定液在載體和流動相中達到分布平衡，形成穩(wěn)定色譜體系。,20.5.1.液液分配色譜,1.鍵合相色譜固定相 鍵合固定相的性能指標有:(1).鍵合量:可以鍵合硅膠含碳量和表面覆蓋率表示，其含碳范圍5%40%，表面覆蓋率1-4mol/m2。(2).按某指定k值溶質(zhì)測定的理論塔板數(shù)。(3).色譜柱滲透性，可以柱前壓度量。(4).兩種不同溶質(zhì)的分離選擇性。(5).保留值k的重現(xiàn)性。(6).色譜峰的對稱性。(7).穩(wěn)定性:耐溶劑和pH范圍。 根據(jù)色譜體系固定相和流動相相對極性，可分為反相和正相鍵合相色譜。,20.5.2鍵合相高效液相色譜,20.5.2.1.化學鍵合、化學吸附色譜固定相,2.化學吸附改性色譜固定相 其典型代表是新近以微粒氧化鋯、氧化鋯/氧化鎂等為基質(zhì)，通過路易斯酸堿化學吸附作用，制備長鏈烷基膦酸(C8-C18)及含極性基團衍生物的非極性和極性色譜固定相。 它們具有耐溶劑、耐酸堿(pH1-12)、化學穩(wěn)定和適用范圍廣的特點，其色譜性能與鍵合硅膠固定相基本類似，而制備簡便、適用堿性化合物、蛋白質(zhì)等生物樣品分離，是一類極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦虷PLC固定相。,20.5.2.1.化學鍵合、化學吸附色譜固定相,反相鍵合相色譜的分離機理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。 這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強的流水特性。 當用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團的有機化合物時，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。,20.5.2.2.鍵合相色譜保留機理,20.5.2.2.鍵合相色譜保留機理,20.5.2.3.反相色譜分離條件優(yōu)化,固定相選擇 改變非極性鍵合相烴基鏈長和鍵合量，鏈長增加導致溶質(zhì)保留值k升高，但長鏈之間k和差別較小，相同表面覆蓋率C18柱保留略大于C8柱。 2. 流動相選擇 改變流動相溶劑性質(zhì)和組成，這是調(diào)節(jié)k和選擇性最簡便、有效的方法。,20.5.2.3.反相色譜分離條件優(yōu)化,3.流動相pH值 流動相緩沖溶液pH值對離子性溶質(zhì)保留有顯著影響，pH值變化可導致k值10倍左右變化，視溶質(zhì)離子化基團多少而異。,4. 衍生化技術 與氣相色譜類似，HPLC也采用衍生化技術，特別是反相色譜，通過樣品組分柱前衍生化可達到兩個目的:一是降低溶質(zhì)極性，提高疏水性;二是向溶質(zhì)中引進檢測響應，主要是紫外吸收、熒光激發(fā)基團，以提高檢測靈敏度或高選擇性檢測響應。溶質(zhì)柱后衍生化則只有利于提高檢測靈敏度。,20.5.2.4.鍵合相色譜應用實例,相對分子質(zhì)量10000的脂溶性樣品一般采用反相色譜分離。,圖20-19. 鄰苯二甲醛柱前衍生化氨基酸RPC分離色譜圖,20.5.2.4.鍵合相色譜應用實例,相對分子質(zhì)量10000的脂溶性樣品一般采用反相色譜分離。,圖20-20.極性氨基柱反相條件下分離糖類化合物物,20.5.3.離子對色譜(Ion-Pair Chromatography),在色譜體系中引入一種與樣品溶質(zhì)離子電荷相反的離子對試劑，通常稱為對離子或反離子(counterion)，它與溶質(zhì)離子形成離子對，從而改變?nèi)苜|(zhì)在兩相中的分配，使離子性溶質(zhì)的保留行為和分離選擇性發(fā)生顯著變化。 常用的離子對試劑有提供陰離子的C4 - C8烷基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、羧酸鹽、萘磺酸鹽、高氯酸鹽等;提供陽離子的季銨鹽和烴基胺，如四丁基銨鹽、十六烷基三甲基銨鹽、三乙胺等。 將離子對試劑涂漬在液液色譜的硅膠載體上或溶于流動相中，可構成液液離子對分配色譜，由于固定相的流失，這類離子對色譜應用不多。 在反相色譜中，離子對試劑加入緩沖液和甲醇、乙腈等極性有機溶劑的流動相構成反相離子對色譜。,20.5.3.離子對色譜(Ion-Pair Chromatography),保留機理：,反相離子對色譜分離水溶性維生素,手性高效液相色譜可分為手性固定相(chiral stationary phase，CSP)/非手性流動相和非手性固定相/含手性選擇劑流動相，即手性流動相兩種色譜技術。具實用價值手性流動相添加劑品種較少，這里主要介紹前者。 采用手性固定相CSP的高效液相色譜體系的流動相與一般分配色譜相似，根據(jù)CSP與流動相相對極性不同可構成正相或反相色譜，其中采用極性水溶性流動相的反相手性色譜應用較多。,20.5.4.手性色譜(Chiral chromatohgaphy),1. 給體-受體手性固定相 這是Pirkle研究組最先開發(fā)的一類CSP,由含末端羧基或異氰酸酯芳香烴手性配體與氨基鍵合硅膠縮合，分別形成具手性取代芳香酰胺或脲型結構CSP，亦稱為Pirkle手性固定相。,20.5.4.手性色譜(Chiral chromatohgaphy),2.多糖類手性固定相 主要是纖維素及其衍生物CSP，以引進芳環(huán)的取代苯甲酸酯衍生化纖維素居多，如纖維素三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)，纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)，纖維素三乙酸酯等。 3.環(huán)糊精手性鍵合固定相 亦稱為空穴型固定相。環(huán)糊精簡稱CD，具手性空穴結構，CD-CSP可實施正相和反相兩種色譜體系。,20.5.4.手性色譜(Chiral chromatohgaphy),4.蛋白質(zhì)手性固定相 一般通過含氨基、二醇基等鍵合硅膠中間體將蛋白質(zhì)鍵合至硅膠上。這類CSP只能用于反相色譜體系。,以生物活性配體(如酶、抗體、激素等)通過間隔臂鍵合到多孔微粒固體基質(zhì)為固定相，不同pH值的緩沖溶液為流動相，依據(jù)生物分子(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核酸等)與固定相配體間的特異、可逆的相互親和作用力差異，即形成可離解的配位復合物，亦稱為鎖-鍵結構復合物或絡合物(lock-and-key structural complex)，實現(xiàn)生物活性分子分離和純化。 固定相由基質(zhì)、間隔臂、和配體三部分組成。 1. 基質(zhì)材料有天然和合成聚合物等有機基質(zhì)。 2. 間隔臂通常為不同鏈長的雙功能基化合物。 3. 固定相配體主要是:(1).染料;(2).具包結絡合作用的大環(huán)化合物;(3).生物特效配體;(4). 與生物活性分子發(fā)生作用的藥物，,20.5.5.親和色譜(Affinity Chromatography),20.5.5.親和色譜(Affinity Chromatography),此法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應用范圍較廣。,20.6.離子交換色譜,離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應通式如下： 陽離子交換：,陰離子交換：,20.6.1.離子交換平衡,達平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應的選擇系數(shù)）：,這里，XRs 、YRs和Xm、Ym分別代表X、Y在固定相上和流動相中濃度。色譜過程分布平衡常數(shù)為溶質(zhì)X在固定相和流動相濃度之比，上式重排得:,20.6.1.離子交換平衡,設色譜柱內(nèi)離子交換劑的質(zhì)量是WS，則固定相上溶質(zhì)的量(mol或g)為XRSWS;柱內(nèi)流動相體積Vm,溶質(zhì)量為XmVm。溶質(zhì)色譜保留值k為: 對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序： Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ 二價離子的順序為： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+ 對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF,20.6.1.離子交換平衡,現(xiàn)在廣泛應用的離子交換固定相主要是三種類型: 1. 苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)聚合物離子交換樹脂。 2. 表面薄殼型無機-有機復合型交換劑。 3. 硅膠化學鍵合離子交換劑。 離子交換色譜流動相具有其他色譜方法相同的要求，即必須溶解樣品，有合適溶劑強度以獲得合理的保留時間和k值，和各溶質(zhì)有差異的相互作用以改進分離選擇性。離子交換色譜流動相是含離子水溶液，常是緩沖劑溶液。 流動相緩沖液的類型、離子強度、pH值及添加有機溶劑類型、濃度等是實現(xiàn)分離條件優(yōu)化的主要因素。,20.6.2.離子交換色譜固定相-離子交換劑和流動相,離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。離子交換色譜法在無機離子的分析和應用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導檢測器，由于被測離子的電導信號被強電解質(zhì)流動相的高背景電導信號掩沒而無法檢測。 為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術。他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應：,20.6.3.離子色譜(Ion Chromatography，IC),由反應可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼Ш苄〉乃?，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的26倍，提高了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。 在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導率極低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。,20.6.3.離子色譜(Ion Chromatography，IC),20.6.3.離子色譜(Ion Chromatography，IC),20.6.4.離子排阻色譜,離子排阻色譜(Ion-exclusion Chromatography)分離測定的是低電離度的分子而不是離子，分離在離子交換柱上實現(xiàn)。 理論基礎是說明離子通過膜擴散的道南(Donnan)平衡，其主要論點是離子交換劑上大體積不擴散離子可排斥同電荷小離子擴散進入該相。由于陽離子和陰離子交換劑排阻離子，使快速通過色譜柱，無保留或保留值很小;而非離子性溶質(zhì)被分布、保留并實現(xiàn)分離。,體積排阻或排除色譜(Size-Exclusion Chromatography,SEC),亦稱為凝膠色譜或凝膠過濾色譜,是分析高分子化合物的色譜技術。SEC填料為微粒均勻網(wǎng)狀多孔凝膠材料。 比填料平均孔徑大的分子被排阻在孔外而無保留，被最先洗出;分子體積比孔徑小的分子完全滲透進入孔穴，最后洗出; 處于這兩者之間具中等大小體積分子滲透進入孔穴，由于滲透能力差異而顯示保留不同，產(chǎn)生分子分級，這取決于分子體積，在一定程度上亦與分子形狀有關。 因此，SEC分離是基于溶質(zhì)分子體積差異在凝膠固定相孔穴內(nèi)的排阻和滲透性大小。,20.7.體積排阻色譜,20.7.1.分離原理,K為溶質(zhì)的分配系數(shù)。Vg凝膠基質(zhì)骨架體積， VS孔穴中溶劑