課件：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù).pptVIP

課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),點此播放教學視頻,課題背景,1、尿素的利用:,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細菌利用尿素的原因:,CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3,脲酶,點此播放教學視頻,3、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌,統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計菌落數(shù)目,.設置對照,點此播放教學視頻,（一）篩選菌株,水生耐熱細菌Taq 耐高溫的Taq DNA聚合酶,選擇培養(yǎng)基 在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,啟示?,點此播放教學視頻,思考：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,點此播放教學視頻,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,3、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理？,點此播放教學視頻,1.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,2、顯微鏡直接計數(shù)：,.統(tǒng)計菌落數(shù)目：,點此播放教學視頻,思考書本22頁問題：,說明設置重復組的重要性。 第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。這個實例啟示學生，在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設置的重復組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。,注意事項 為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。 為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。,點此播放教學視頻,計數(shù)法,直接計數(shù)法、 活菌平板計數(shù)法、 比濁法（原理是在一定范圍內(nèi)，菌的懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量。） 膜過濾法（當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上 ( 或一定面積中 ) 的細菌數(shù) ）,設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,.設置對照：,實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),點此播放教學視頻,小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設置是必不可少的。,方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗,方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預測：如果結(jié)果與A同學一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,點此播放教學視頻,二.實驗的具體操作 .土壤取樣 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,點此播放教學視頻,應在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板,三樣品的稀釋,點此播放教學視頻,思考：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。 結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,點此播放教學視頻,.取樣涂布,實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。,點此播放教學視頻,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,點此播放教學視頻,實驗設計步驟： 1、土壤取樣 2、制備培養(yǎng)基： 3、樣品的稀釋 4、取樣涂布 5、微生物的培養(yǎng)與觀察,點此播放教學視頻,2019/8/31,19,可編輯,微生物的培養(yǎng)與觀察,1、結(jié)合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。 2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在30300的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相近？ 3、你統(tǒng)計的每克土壤中含有能分解尿素的細菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？,三.結(jié)果分析與評價,對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)中無菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基，說明選擇培養(yǎng)基具有選擇作用。,四.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。,測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,點此播放教學視頻,大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征,點此播放教學視頻,本課題知識小結(jié):,點此播放教學視頻,例2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時期是 A調(diào)整期 B對數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期,解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應了種內(nèi)生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個體數(shù)目的增加，每個個體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個個體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時的微生物的生存斗爭主要是與無機環(huán)境的斗爭。,答案：C,點此播放教學視頻,3.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 4.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,C,D,點此播放教學視頻,5.下列說法不正確的是（ ） A.科學家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。 6.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（ ） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,點此播放教學視頻,利用生物工程生產(chǎn)啤酒、味精、胰島素、酸奶的常用菌種分別是（ ） A酵母菌、枯草桿菌、大腸桿菌、乳酸菌 B酵母菌、大腸桿菌、青霉菌、乳酸菌 C酵母菌、谷氨酸棒狀桿菌、大腸桿菌、乳酸菌 D黃色短桿菌、酵母菌、大腸桿菌、乳酸菌,C,點此播放教學視頻,測定土壤中細菌數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)，而測定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋，其原因是( ) A細菌個體小，真菌個體大 B細菌易稀釋，真菌不易稀釋 C細菌在土壤中數(shù)量比真菌多 D隨機的，沒有原因,C,點此播放教學視頻,用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設置的對照是( ) A未接種的選擇培養(yǎng)基 B未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 C接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 D接種了的選擇培養(yǎng)基,C,選C。將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，應選牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照。對照遵循的是單一變量原則，所以與選擇培養(yǎng)基一樣接種、培養(yǎng)。,點此播放教學視頻,分離土壤中分解尿素的細菌，對培養(yǎng)基的要求是( ) 加尿素 不加尿素 加瓊脂 不加瓊脂 加葡萄糖 不加葡萄糖 加硝酸鹽 不加硝酸鹽 A B C D,C,土壤中分解尿素的細菌能夠合成脲酶，將尿素分解生成氨，利用尿素中的氮合成自身有機物。培養(yǎng)基中只加尿素，分解尿素的細菌能生長，其他微生物不能生長；分離微生物要用固體培養(yǎng)基；土壤中分解尿素的細菌屬于異養(yǎng)微生物，需要加葡萄糖作為碳源。,根據(jù)實驗原理和材料用具，設計實驗確定細菌質(zhì)粒的抗菌素基因所抗的抗菌素的類別。 實驗原理：作為運載體的質(zhì)粒帶有標記基因，這一標記基因是抗菌素抗性基因，即有抗性基因的質(zhì)?？捎米鲞\載體。 材料用具：青霉素、四環(huán)素各10萬單位溶液、菌種試管、滅菌的含細菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿、酒精燈、接種環(huán)、一次性注射器、無菌水、恒溫箱。 方法步驟： 第一步：分組。_， 用三