白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測ppt課件

白細(xì)胞抗原檢測,目 錄,第一節(jié) HLA血清學(xué)檢測 HLA抗原檢測 HLA抗體檢測 第二節(jié) HLA細(xì)胞學(xué)檢測 第三節(jié) HLA分子生物學(xué)檢測 HLA的分子生物學(xué)檢測方法 HLA常見基因分型方法比較 HLA分型模棱兩可結(jié)果的原因及其對(duì)策 第四節(jié) 粒細(xì)胞抗原抗體檢測,第一節(jié) HLA血清學(xué)檢測,重點(diǎn)提示,HLA抗原檢測 掌握微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)的原理及其影響因素 HLA抗體檢測方法 淋巴細(xì)胞毒方法 流式細(xì)胞儀方法 ELISA方法 Luminex檢測技術(shù) 掌握不同方法的原理及其優(yōu)缺點(diǎn),微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn),HLA抗原的血清學(xué)分型方法 用一系列已知的抗HLA標(biāo)準(zhǔn)分型血清來檢測未知淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原型別 微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)原理 基于抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體免疫復(fù)合物在補(bǔ)體的作用破壞細(xì)胞膜 利用染料或其它方法鑒定和區(qū)分死活細(xì)胞 計(jì)分法：NIH計(jì)分法,HLA抗血清的來源,HLA抗體血清來源 同種免疫刺激產(chǎn)生HLA同種抗體 HLA抗原免疫刺激動(dòng)物 雜交瘤技術(shù) 人群存在的天然抗體,微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)的影響因素,HLA抗血清 抗血清來源和抗體種類、抗血清效價(jià)、抗血清特性、抗血清質(zhì)量 淋巴細(xì)胞 淋巴細(xì)胞活性 、淋巴細(xì)胞純度、淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞上抗原表達(dá)異常 孵育時(shí)間和溫度 補(bǔ)體活性 染色和固定時(shí)間,血清學(xué)抗原分型方法評(píng)價(jià),血清學(xué)方法抗原分型 檢測HLA-類和類抗原 檢測HLA-類抗原相對(duì)容易 檢測HLA-類抗原需要分離和純化淋巴細(xì)胞 易受多種因素影響 其錯(cuò)誤率相對(duì)較高 HLA血清學(xué)某一座位上只能檢測到一個(gè)抗原，而基因分型存在兩個(gè)不同等位基因，應(yīng)考慮到無效等位基因,HLA抗體檢測,補(bǔ)體依賴的淋巴細(xì)胞毒方法（CDC） 采用淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞抗原 易受多種因素影響，檢測敏感性最低 ELISA 方法 ELISA方法能檢測HLA-I和HLA-II抗體 流式細(xì)胞術(shù) 采用淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞抗原 結(jié)合熒光檢測技術(shù)特點(diǎn) Luminex檢測技術(shù) 結(jié)合熒光流式細(xì)胞儀和免疫標(biāo)記技術(shù) 可區(qū)分HLA-I和HLA-II抗體 可鑒定抗體的屬性和強(qiáng)度,HLA抗體檢測,Luminex檢測技術(shù) 以包被抗原的微球磁珠作為靶細(xì)胞 每種磁珠上包被一種抗原 多種磁珠可以在同一體系內(nèi)反應(yīng) 待測血清與磁珠孵育 存在HLA抗體時(shí)，形成抗原-抗體復(fù)合物 加入熒光標(biāo)記的抗人IgG抗體 形成抗原-抗體-熒光標(biāo)記抗體復(fù)合物 Luminex儀測定微球磁珠上的熒光值 判定HLA抗體的強(qiáng)度和特異性 微球磁珠熒光值大小 每種磁珠的反應(yīng)特性,第二節(jié) HLA細(xì)胞學(xué)檢測,重點(diǎn)提示,掌握下列方法的基本原理及其應(yīng)用 混合細(xì)胞培養(yǎng)方法（mixed lymphocyte culture，MLC） 純合分型細(xì)胞（homozygote typing cell,HTC） 預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)（primed lymphocyte test,PLT）,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC） 二個(gè)無關(guān)個(gè)體的淋巴細(xì)胞在體外混合一起培養(yǎng) 二者組織相容性抗原不同，互相刺激對(duì)方的T細(xì)胞發(fā)生增殖 增殖反應(yīng)強(qiáng)度與組織相容性抗原的差異程度成正比 轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、核內(nèi)DNA和RNA合成增加 MLC 用于HLA-D抗原分型 實(shí)體器官移植前的快速相容性檢測 分為雙向MLC和單向MLC,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),雙向MLC 雙方的淋巴細(xì)胞互相刺激而增生、轉(zhuǎn)化，即雙方的淋巴細(xì)胞既是刺激細(xì)胞，又是反應(yīng)細(xì)胞 抗原相同或相容，則刺激作用很小，細(xì)胞無變化 抗原不相容，則刺激作用大，細(xì)胞被活化并產(chǎn)生增殖 單向MLC 一方的淋巴細(xì)胞用X線照射或用絲裂霉素C處理 喪失增殖反應(yīng)能力而仍保留其抗原刺激效應(yīng) MLC只有一方淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)，故可了解單一個(gè)體淋巴細(xì)胞的刺激強(qiáng)度和應(yīng)答程度,純合細(xì)胞分型方法,純合細(xì)胞分型方法（也稱為陰性分型） 已知HLA-Dw型別的經(jīng)滅活的純合子細(xì)胞作為刺激細(xì)胞 待檢細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞 兩種細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 若不發(fā)生或僅發(fā)生弱的增殖反應(yīng) 表明受檢細(xì)胞具有與純合子分型細(xì)胞相同的HLA-Dw型別，它可能為特定HLA-Dw型的純合子或雜合子 發(fā)生增殖反應(yīng) 表明受檢細(xì)胞不具有純合子細(xì)胞擁有的HLA-Dw型別,預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（PL）,預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（PL） 僅對(duì)一種單體型具有識(shí)別增殖能力，而處于靜止?fàn)顟B(tài)的小淋巴細(xì)胞 作為應(yīng)答細(xì)胞參與了初次MLC反應(yīng)，經(jīng)過增殖后又回到小淋巴細(xì)胞 遇到相應(yīng)抗原刺激后，迅速發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖,預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn),預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)（又稱為陽性分型法) PL細(xì)胞作為已知的分型細(xì)胞 待檢淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞 待檢淋巴細(xì)胞分別與一系列的預(yù)致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行單向MLC 待檢細(xì)胞與預(yù)致敏淋巴細(xì)胞預(yù)先識(shí)別的抗原相同，預(yù)致敏淋巴細(xì)胞會(huì)迅速增殖 預(yù)致敏淋巴細(xì)胞分型試驗(yàn)是用陽性反應(yīng)作為判定標(biāo)準(zhǔn),第三節(jié) HLA分子生物學(xué)檢測,重點(diǎn)提示,HLA的分子生物學(xué)檢測方法 掌握PCR-SSP、PCR-SSO、Luminex檢測技術(shù)、基因芯片、PCR-SBT的基本原理 掌握HLA常見基因分型方法的特點(diǎn)及其適用范圍 HLA高分辨分型中模棱兩可結(jié)果的原因及其對(duì)策 明確其形成原因 掌握4種常見方法的原理及其應(yīng)用,HLA分子生物學(xué)檢測,HLA基因分型技術(shù)主要方法 PCR序列特異性引物（PCR sequence specific primer, PCR-SSP） PCR序列特異性寡核苷酸探針技術(shù)（PCR sequence specific oligonucleotide probe, PCR-SSO） Luminex檢測技術(shù) 基因芯片 核苷酸序列測定法（PCR sequence based-typing，PCR-SBT）,PCR序列特異性引物,PCR序列特異性引物（PCR-SSP） 根據(jù)HLA等位基因核苷酸堿基序列的差異性，設(shè)計(jì)出一系列特異性引物 引物3端最后一個(gè)堿基是否與其等位基因DNA模板配對(duì)起決定作用 根據(jù)多對(duì)引物擴(kuò)增的結(jié)果可以指定HLA基因型 方法操作簡單，快速耗時(shí)較短，結(jié)果判斷簡便 有低分辨和高分辨分型試劑，為實(shí)驗(yàn)室常用的方法之一 可能出現(xiàn)假陽性帶或漏帶現(xiàn)象 某些罕見的HLA等位基因存在錯(cuò)誤結(jié)果,PCR序列特異性寡核苷酸探針,PCR序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSO) 利用核酸互補(bǔ)的雜交技術(shù) 特異性引物擴(kuò)增目的DNA片段 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針進(jìn)行雜交 酶促反應(yīng)體系或顯色（影）溶液進(jìn)行顯色 無顏色顯示 基因片段與探針不互補(bǔ) 顯示顏色 基因片段與探針互補(bǔ) 根據(jù)多個(gè)探針雜交信號(hào)結(jié)果進(jìn)行HLA分型指定,Luminex檢測技術(shù),Luminex檢測技術(shù) 原理是利用核酸互補(bǔ)的雜交技術(shù) 每一種微球上只固定一種已知序列的特異性探針 利用特異性引物擴(kuò)增目的DNA片段 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與多種微球在同一孔內(nèi)進(jìn)行特異性雜交 雜交后加入熒光顯色劑 Luminex檢測儀綠色激光束檢測雜交信號(hào) Luminex檢測儀紅色激光束區(qū)分探針的種類 擴(kuò)增基因片段與探針不互補(bǔ)，在微球上無熒光顯示 擴(kuò)增基因片段與探針互補(bǔ)，在微球上有熒光顯示 根據(jù)熒光值強(qiáng)度大小可以判定待測片段是否與探針互補(bǔ),基因芯片技術(shù),基因芯片技術(shù) 技術(shù)原理是根據(jù)核酸互補(bǔ)的雜交技術(shù)，并結(jié)合激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)特性 在特定載體（玻璃、硅等）上高密度有序地排列特定寡核苷酸片段作為探針 對(duì)待檢標(biāo)本HLA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增并熒光標(biāo)記 將待測標(biāo)記的HLA基因片段與特定探針進(jìn)行雜交 基因片段與探針不互補(bǔ)，該探針位置無熒光顯示 基因片段與探針互補(bǔ)，該探針位置可顯示熒光 通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，根據(jù)熒光值強(qiáng)度大小可以判定待測片段是否與探針互補(bǔ),核苷酸序列測定法,核苷酸序列測定法（PCR-SBT） 擴(kuò)增目的DNA片段 對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測序分析 指定HLA等位基因型別 根據(jù)測序序列中核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)堿基情況，與已知可能的等位基因的序列進(jìn)行比較 直接檢測基因的核苷酸序列 屬于高分辨方法，結(jié)果準(zhǔn)確性最高 直接雙鏈測序過程中存在模棱兩可基因型結(jié)果,新一代測序技術(shù),新一代測序（NGS）技術(shù) 市場上有多種技術(shù)平臺(tái)，其測序原理上存在差異 NGS已應(yīng)用于HLA分型 其關(guān)鍵在于如何系統(tǒng)建立好HLA位點(diǎn)的DNA文庫 片段擴(kuò)增和測序步驟則取決于所用的技術(shù)平臺(tái) 應(yīng)用于HLA-I和HLA-II位點(diǎn)分型 單鏈測序結(jié)果 NGS進(jìn)行HLA分型存在一定的偏差,HLA常見基因分型方法比較,模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因,PCR-SSP的模棱兩可結(jié)果 PCR-SSP方法針對(duì)同一座位上不同等位基因堿基多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物 引物可特異性針對(duì)單一或多個(gè)等位基因 只擴(kuò)增某特定的單一等位基因 可直接指定特定單一等位基因 引物對(duì)常擴(kuò)增HLA某一座位數(shù)個(gè)等位基因 存在多種可能性 PCR-SSP方法可產(chǎn)生一定的模棱兩可分型結(jié)果 采用不同引物對(duì)的組合方式來指定或排除某個(gè)等位基因 等位基因數(shù)量較多而且引物大多針對(duì)多個(gè)等位基因,模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因,PCR-SSO的模棱兩可結(jié)果 探針的序列決定其特異性 部分探針只與某一等位基因序列互補(bǔ)雜交 標(biāo)本與該探針雜交可明確無誤地指定相應(yīng)特定等位基因 絕大多數(shù)探針能夠與多種等位基因序列互補(bǔ)雜交 無法單純依靠這種探針進(jìn)行等位基因指定 探針反應(yīng)格局表通過數(shù)理邏輯關(guān)系指定HLA基因型 大量探針往往針對(duì)多個(gè)等位基因，錯(cuò)綜復(fù)雜的雜交格局，導(dǎo)致產(chǎn)生模棱兩可的分型結(jié)果,模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因,PCR-SBT的模棱兩可結(jié)果 雙鏈測序反應(yīng)得到的序列是兩個(gè)等位基因序列的組合 測序獲得的序列與多種等位基因的組合序列完全匹配 有三種情況可能引起模棱兩可的結(jié)果 測序區(qū)域未包括這些等位基因核苷酸的區(qū)分點(diǎn) A*74:01和A*74:02僅在第1號(hào)外顯子存在差別(第67位) 大多數(shù)等位基因未測定全部外顯子序列 HLA-A*02:08、HLA-A*03:06缺乏第4外顯子序列 多種等位基因組合在測序區(qū)域內(nèi)具有相同的雜合序列 DRB1*03:01:01G+DRB1*13:32、DRB1*03:06+DRB1*13:93和DRB1*03:12+DRB1* 13:40的組合在2號(hào)外顯子表現(xiàn)為完全相同的雜合序列,模棱兩可結(jié)果區(qū)分的策略,模棱兩可結(jié)果區(qū)分的方法 常見及確認(rèn)等位基因原則（Common alleles and well documented alleles，CWD） 結(jié)合多種方法結(jié)果進(jìn)行綜合判斷 改用其它廠家的試劑 增加測序的范圍或雜交的探針數(shù) 采用單鏈DNA抽提技術(shù) 采用單鏈擴(kuò)增技術(shù) 采用組特異性測序引物技術(shù) 克隆轉(zhuǎn)染后形成單鏈后檢測,CWD原則,HLA等位基因定義為三大類 常見等位基因（Common alleles） 指那些在參考群體中頻率大于0.001的等位基因 確認(rèn)等位基因（Well-documented alleles） 至少在五個(gè)獨(dú)立非親緣個(gè)體中或者三個(gè)獨(dú)立非親緣個(gè)體中并伴有特定的單體型被檢測到的等位基因 罕見等位基因（Rare alleles) 除常見等位基因和確認(rèn)等位基因以外的所有等位基因 它們的頻率很低,CWD原則,CWD原則 CWD原則分型中將常見等位基因和確認(rèn)等位基因合并為CWD,當(dāng)模棱兩可的等位基因組合中出現(xiàn)CWD等位基因可能需要進(jìn)一步區(qū)分，而出現(xiàn)罕見等位基因組合，其臨床分型中實(shí)際意義有限，可予以排除,單鏈DNA抽提技術(shù),單鏈DNA抽提技術(shù)將個(gè)體兩個(gè)等位基因進(jìn)行分離 根據(jù)等位基因序列設(shè)計(jì)生物素標(biāo)記的特異性探針（僅與某一等位基因互補(bǔ)） 探針與標(biāo)本基因組DNA進(jìn)行雜交反應(yīng) 雜交后將形成單一等位基因DNA/特異性探針復(fù)合物 加入鏈親和素標(biāo)記磁珠，將形成單一等位基因DNA/特異性探針/磁珠復(fù)合物 洗滌后溶液中只含有單一等位基因DNA/特異性探針/磁珠復(fù)合物,單鏈DNA抽提技術(shù),單鏈分離技術(shù) 探針結(jié)合雜交互補(bǔ) 選擇性獲取單體型 商業(yè)產(chǎn)品 HLA-C*01:02 Biotin-CTC CAT gAA gTA TTT CTT CA,圖為單鏈抽提C*01:02后測序的一段序列,單鏈擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)原理類似于PCR-SSP 選擇合適的引物只擴(kuò)增個(gè)體兩個(gè)等位基因的特定等位基因 比對(duì)序列 設(shè)計(jì)特異性引物 重點(diǎn)在于引物序列 TGGCGCCCCGAACCCTCG,圖為單鏈擴(kuò)增A*24:02后測序的一段序列,組特異性測序引物技術(shù),該技術(shù)原理利用特異性引物進(jìn)行測序反應(yīng) 在測序過程中設(shè)計(jì)特異性的測序引物 該引物只能與某一個(gè)等位基因的序列互補(bǔ) 該引物測序?qū)⒌玫脚c引物序列互補(bǔ)的某個(gè)特定等位基因的序列 A-98T CACTCCATGAGGTATTTCTT A-98A CACTCCATGAGGTATTTCTA,圖為A*02:01,11:01用特異性引物測序后的比較,第四節(jié) 粒細(xì)胞抗原抗體檢測,重點(diǎn)提示,掌握粒細(xì)胞抗原、抗體檢測血清學(xué)診斷方法的原理 粒細(xì)胞凝集試驗(yàn) 粒細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn) 流式細(xì)胞技術(shù) 單克隆抗體粒細(xì)胞抗原捕獲試驗(yàn) ELISA方法 掌握HNA系統(tǒng)基因分型技術(shù)原理及其適應(yīng)范圍 PCR限制性片段長度多態(tài)性 PCR序列特異性引物 PCR直接測序法 多重SNaPshot 技術(shù),粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法,粒細(xì)胞凝集試驗(yàn)（GAT方法） 分離新鮮的粒細(xì)胞 在Terasaki微量板上進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 待測粒細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)抗血清反應(yīng)后或標(biāo)準(zhǔn)粒細(xì)胞與待檢血清反應(yīng)后在顯微鏡下觀察粒細(xì)胞凝集情況 依據(jù)細(xì)胞凝集情況來判定抗原或抗體的特性 早期建立的方法，操作簡單 方法靈敏度、特異性都不高 HLA抗體和某些高滴度的免疫復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果,粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法,粒細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)（GIFT） 直接法用于檢測粒細(xì)胞抗原 熒光標(biāo)記的粒細(xì)胞抗體與待檢粒細(xì)胞反應(yīng) 有相應(yīng)的抗原存在時(shí)可形成抗原抗體反應(yīng) 通過熒光顯微鏡檢測熒光的情況 間接法用于檢測粒細(xì)胞抗體或抗原 分離出新鮮的粒細(xì)胞與待檢血清反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體時(shí)可形成抗原抗體結(jié)合物 洗滌后加入熒光標(biāo)記的抗人IgG反應(yīng)，繼續(xù)形成抗原-抗體-熒光標(biāo)記抗人IgG結(jié)合物，洗滌后通過熒光顯微鏡檢測熒光的情況 敏感性、特異性均優(yōu)于GAT法 需要熒光顯微鏡，實(shí)驗(yàn)干擾因素較多,粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法,流式細(xì)胞技術(shù) 檢測粒細(xì)胞抗原或抗體 以抗體檢測為例闡述其原理 將粒細(xì)胞與待檢血清進(jìn)行反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體時(shí)可形成抗原抗體結(jié)合物 洗滌后加入熒光標(biāo)記的抗人IgG-Fc、IgM-Fc 繼續(xù)形成抗原-待檢抗體-熒光標(biāo)記抗人Ig結(jié)合物 通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測熒光的情況 該方法敏感性、特異性較好,粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法,單克隆抗體粒細(xì)胞抗原捕獲試驗(yàn)( MAIGA方法) 粒細(xì)胞與待檢血清反應(yīng)，存在相應(yīng)抗體可形成抗原抗體復(fù)合物 加入特定的單克隆抗體，形成單克隆抗體-抗原-抗體三聯(lián)復(fù)合物 細(xì)胞裂解離心獲取上清液（含三聯(lián)復(fù)合物），將其加入到包被特定抗體的ELISA板微孔內(nèi)反應(yīng)，可形成包被抗體-單克隆抗體-粒細(xì)胞抗原-待測抗體復(fù)合物 洗滌后加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體形成包被抗體-單克隆抗體-粒細(xì)胞抗原-待測抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物 顯色劑比色分析，根據(jù)顯色程度判定抗體情況,粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法,ELISA方法 特異性單克隆抗體包被的微板 加入粒細(xì)胞抗原和待檢血清反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體可形成包被抗體-抗原-待測抗體復(fù)合物 加入酶標(biāo)記的抗人IgG形成包被抗體-抗原-待測抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物 加顯色劑進(jìn)行比色分析 根據(jù)顯色程度判斷抗體的有無和強(qiáng)度 ELISA方法敏感性和特異性較好,HNA系統(tǒng)基因分型技術(shù),PCR限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP) PCR擴(kuò)增目的DNA片段，產(chǎn)物采用合適的限制性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，電泳后進(jìn)行分辨 HNA不同等位基因的酶切圖譜不同 PCR-RFLP方法簡便，分型時(shí)間較短 已成功用于HNA-4a 和-5a的分型 PCR序列特異性引物（PCR-SSP） 根據(jù)HNA系統(tǒng)等位基因核苷酸堿基序列差異性設(shè)計(jì)引物 引物3端堿基與等位基因的特異性堿基相匹配 根據(jù)PC