杜氏肌營養(yǎng)不良癥DMD與遺傳.ppt

,疾病概述,Dystrophie musculaire de Duchenne,DMD，杜氏肌營養(yǎng)不良，假肥大型肌營養(yǎng)不良 Dystrophine（Dys） 抗肌萎縮蛋白 缺失 Maladie monogenique Htdit: XR Duchenne, un neurologiste franais, a donn une description complte de 13 maladies attaints,Phnotype Clinique de la DMD,Les muscles jumeaux des jambs des garons atteints apparaissent quils soient dvelopps Mais asthniques 假性肌肥大 Tissu conjonctif et la graisse,Phnotype Clinique de la DMD,12 ans normal 3 5 ans dveloppe une faiblesse musculaire Ds lge de 12 ans confin en chaise roulant Au-del de lge de 20 ans ne survivra QI 智商 une chute modr denviron 20 points,Lab Cratine kinase (niveau srique)血清濃度 50 100 fois la limite suprieure de la normale dans les stades prcoces,Dystrophie musculaire de Becker,le gne de la dystrophie Beaucoup plus attnu 緩和 Aprs lge de 16 ans parvient marcher 之后多年也可行走,DMD與BMD的差異,DMD致死 BMD存活率非常高(70%),易產(chǎn)生 新的突變,遺傳,遺傳特征,Htdit: XR,遺傳特征,（1）系譜中常常只有男性患者 （2）父母都無病時，女兒則不會發(fā)病，兒子可能發(fā)病； （3）由于交叉遺傳，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常為本病患者； （4）由于男性患者的子女都正常，故可見隔代遺傳； （5）女性患者的父親一定是患者,母親一定是攜帶者。,DMD 男女差異,男性致死 1/3 nomutation,2/3 mre porteuse 女性攜帶者 Majorit 無任何臨床表現(xiàn)，70% 肌酸激酶(Cratine kinase ) 增高 8% 輕微的肌肉癥狀,有些還有嚴(yán)重的近心端肌肉障礙。 女性很少患有DMD,母系鑲嵌,某男性是家族中DMD的先證者 他的母親沒有攜帶突變基因 遺傳位點上發(fā)生了新近的突變 大約5%-15%的這些發(fā)生的例子是由于母系生殖鑲嵌,DMD 發(fā)病率較高,Garons nouveau-ns：1/3300 Un taux de mutation ：1/10000 每天一個男性每11-12秒會產(chǎn)生1個新突變的精子（8 x 107 par jour）,基因與蛋白,Gne DMD,人類最大的基因之一，2300 kb 位于Xp 占X 染色體全長的1.5% 99% 的序列由內(nèi)含子組成 編碼區(qū)包括79個外顯子及7 個組織特異性的啟動子 其mRNA 序列長114 kb 主要表達(dá)于骨骼肌、心肌，少量表達(dá)于腦組織,7 個組織特異性的啟動子,B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S(施旺細(xì)胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官) B 型：大腦皮層、海馬回神經(jīng)元 P型：小腦蒲肯野細(xì)胞, 在骨骼肌也有極少量的表達(dá) M 型：骨骼肌、心肌組織, 同時在腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá),Dystrophin 抗肌萎縮蛋白,全長型dystrophin 是一種427 kDa的棒狀蛋白, 長約150 nm, 分為4 個區(qū)域， 氨基端區(qū)域 中央棒狀區(qū) 富含半胱氨酸區(qū)域 羧基端區(qū)域,A. 位于Xp21, 黑色的豎線代表分布于整個基因上的79 個外顯子, 黑色箭頭指示各組織特異性啟動子不同的啟動位點, 分別以不同的字母縮寫來代表, B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S( 施旺細(xì)胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官) 。 B. 不同形式的dystrophin 蛋白及其區(qū)域組成, 氨基端、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域,DMD患者：60%基因突變表現(xiàn)為缺失 一般在基因的5端和中央棒區(qū)兩個區(qū)域 BMD患者：可能缺失了一個或者幾個基因序列 dystrophine蛋白的特點 DMD患者體內(nèi)很少或者沒有 BMD患者體內(nèi)有表達(dá)，但是仍然比正常人少,臨床治療,DMD治療,目前為止尚無治療DMD的有效方法 藥物治療（對癥治療）：糖皮質(zhì)激素治療 短期口服激素治療可增強(qiáng)骨骼肌力量和功能，并可能在更長時間內(nèi)穩(wěn)定骨骼肌力量和功能 基因治療：利用不直接引起人類疾病，免疫原性較小的腺相關(guān)病毒（AAV）為載體，導(dǎo)入人工剪裁的Dys基因 修正肌肉組織(占全身體重40)的基因缺陷遇到各種各樣的困難 康復(fù)治療、矯形治療、社會心理治療等,臨床檢測,產(chǎn)前診斷和雜合子診斷,90%攜帶者孕婦中產(chǎn)前診斷可能有至少95%的精確度 由于基因突變導(dǎo)致基因的缺失或者多倍體的家庭中，60%-70%可以直接通過southern印跡雜交技術(shù)或者PCR技術(shù)來測量胎兒的DNA得到 在其余的基因缺失不能明確診斷出來的家庭中，可以通過鍵的標(biāo)記來完成產(chǎn)前診斷 與患病男性結(jié)婚的女性中 75%的女性：DNA檢查、CK血清濃度檢查胎兒是否攜帶 25%女性難檢測： 第一，在病程的一些時期，基因缺陷是無法被檢查出來的（可能情況就是等位基因是正常的或者突變的等位基因位于另外一條X染色體上） 第二，一些家庭的一些成員的樣本丟失了 第三，兩個標(biāo)記基因之間的基因重組在X染色體傳入下一代之前發(fā)生了（母系鑲嵌）,產(chǎn)前檢測,生物化學(xué)檢查CK血清濃度 基因診斷 多重PCR Southern blot 探針連接多重擴(kuò)增(MLPA) 變性高效液相色譜(DHPLC) 抗肌萎縮蛋白的免疫組化,多重PCR方法DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù),可直接檢出DMDBMD的缺失型突變 65的患者為基因缺失所致 多重PCR:使用多對引物的 針對DMD基因的缺失熱區(qū)，利用多對PCR引物在一個PCR管中同時擴(kuò)增多個外顯子，通過和正常對照相比較而判斷外顯子的缺失情況,多重PCR方法,優(yōu)點： 1、具有敏感、特異性強(qiáng)和可重復(fù)性好的優(yōu)點 2、需要的DNA量少、操作簡單 局限性: 1. 女性攜帶者正常x染色體的屏蔽效應(yīng)，無法檢出 2.多重PCR體系內(nèi)，由于引物之間的相互競爭，有時也會出現(xiàn)個別片段擴(kuò)增的假陰性結(jié)果。（對初次擴(kuò)增呈陰性結(jié)果的片段進(jìn)行再次擴(kuò)增，以驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性）,Southern blot方法DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù),是一種常用的DNA定量的分子生物學(xué)方法 原理 將待測的DNA樣品固定在固相載體(硝酸纖維膜或尼龍膜)上 與同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交 在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號 通過檢測信號的有無、強(qiáng)弱可以對樣品定性、定量，從而計算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù),Southern blot方法,優(yōu)點：Southern雜交準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng) 缺點： 1、不經(jīng)過靶片段的擴(kuò)增(PCR)，一般每個電泳通道需要1030g的DNA，在實際操作中就需較大量的DNA樣品 2、Soutllem雜交不能確定缺失的準(zhǔn)確外顯子范圍，對檢測女性重復(fù)突變(duplication)或三重重復(fù)(triplication)攜帶者存在困難 3、由于DMD基因很大，需要6到8個cDNA探針，雜交反應(yīng)才能覆蓋整個DMD基因，要12周時間用來分析，勞動量大 4、需要使用放射性同位素作為示蹤物，會對工作環(huán)境帶來污染,多重探針連接依賴性擴(kuò)增技術(shù) MLPA,multiplex probe ligation dependent amplification 原理 針對所有需要檢測突變的DNA序列，設(shè)計多對特異探針 固定在尼龍膜上 和待測樣品DNA雜交然后洗膜（正常序列和探針雜交后不被洗脫） 利用連接酶把探針連接起來 使用一套通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物用PCR儀進(jìn)行分析，DNA片段的缺失重復(fù)以及拷貝數(shù)以測序儀得到信號的有無及信號的峰高或面積進(jìn)行計算,優(yōu)點： 可以在1個PCR管中完成多達(dá)40個外顯子的缺失重復(fù)檢測 專門用于DMD缺失重復(fù)檢測的試劑盒，通過2個PCR反應(yīng)就可以完成79個外顯子及其非翻譯序列的缺失重復(fù)突變篩查 靈敏度高、操作簡單、可重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)快捷,DMD患者(A)及其母親(B)的20-47號外顯子的MLPA檢測結(jié)果,變性高效液相色譜 DHPLC,denaturing high performance liquid chromatography 原理 用離子對逆向?qū)游龇ǚ蛛x并檢測異源雙鏈 通過三乙基醋酸鈉（TEAA)作為橋分子