雙向電泳培訓(xùn)師培訓(xùn)講義.doc

Bio-Rad 雙向電泳培訓(xùn)講義(2006年3月上海)內(nèi) 容1. 培訓(xùn)前的準備工作-32. 培訓(xùn)目的及要求-33. 時間安排-34. 雙向電泳常用儀器及試劑清單-45. 儀器清點(IEF,Mini Protean3, ProteanII) -56. 儀器開機檢查-77. 概述 蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳-88. 雙向電泳實驗流程-99. 2D Start Kit簡介 -1010. 雙向電泳演示實驗操作步驟-11附1實驗注意事項-17附2 聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的配方-2111. IEF使用過程中的常見及解決方-2212. 雙向電泳中實驗中常見問題-2413. 雙向電泳培訓(xùn)測試題- -40本講義以2D Start Kit為主要操作流程，如對雙向電泳實驗原理及樣品品備有興趣，請參考“雙向電泳實驗指南”（藍色印刷版），如自行配制試劑可參考“BIO-RAD雙向電泳中文手冊”一、 培訓(xùn)前的準備工作1 核對合同清單及裝箱單2 檢查是否有所需的全部試劑3 檢查是否有所需的全部儀器（IEF主機，MiniP3，電源，GS800，PDQuest軟件）4 電話確認培訓(xùn)時間、地點及人員，并就培訓(xùn)內(nèi)容及相關(guān)儀器和試劑和老師進行確認。5 打印培訓(xùn)資料二、 培訓(xùn)目的及要求1 通過本次培訓(xùn)，掌握儀器的基本操作，并能對用戶進行簡單培訓(xùn)，保證用戶能正常使用2D系統(tǒng)進行科研活動2 初步掌握對用戶進行培訓(xùn)的基本知識，并能合理安排培訓(xùn)進程。3 學(xué)會對一些應(yīng)用過程中簡單問題的處理方法4 學(xué)習(xí)雙向電泳的基礎(chǔ)知識5 能對IEF進行正確編程，對正確組裝Mini Protean III，灌膠、正確設(shè)置電泳參數(shù)。 三、 時間安排三天（以2人計算、兩塊7cm小膠）在客戶處培訓(xùn),可根據(jù)實際情況調(diào)整第一天下午2：00 3：30 實驗原理及操作注意事項3：30 5：00 雙向電泳第一向操作示范第二天上午9：0011：30 第二向準備工作及部分儀器演示第二天下午1：00 5：00 轉(zhuǎn)移及第二向電泳，凝膠染色第三天上午9：0011：00 雙向電泳軟件培訓(xùn),實驗討論四. 雙向電泳常用儀器及試劑清單儀器清單（客戶因購買情況不同可能不一樣）CatDescription用戶有的請打鉤165-4000PROTEAN IEF System, complete165-3301Mini Protean 3165-3176PROTEAN II XL Multi-Cell, wide-format, 1.0 mm165-3188PROTEAN II XL Cell, wide-format, 1.0 mm165-4100Mini-Protean 3 Dodeca Cell165-4151PROTEAN Plus Dodeca Cell, 220/240 V165-4121Model 495 Gradient Former, 100-1,500 ml165-2005Exponential Piston, for Model 395/495 gradient former165-2008Tubing Connection Kit164-5070PowerPac Universal Power Supply, 100-120V/220-240V164-5050PowerPac Basic Power Supply, 100-120V/220-240V164-5052PowerPac HC Power Supply, 100-120V/220-240V試劑清單：CatDescriptionBio-Rad產(chǎn)品用戶自行配制第一向等電聚焦相關(guān)試劑163-21052-D starter kit163-2001ReadyPrep IPG Strips, pH 4-7, 7cm, 12163-2129Mineral Oil, 500 ml第二向SDS PAGE電泳相關(guān)試劑161-015830% Acrylamide/Bis Solution,37.5:1, 500 ml161-0416SDS Solution, 10% (w/v), 250 ml161-0798Resolving Gel Buffer, 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8, 1 L161-0700Ammonium Persulfate, 10 g161-0800TEMED, 5 ml161-073210x Tris/Glycine/SDS, 1 L染料161-0786Bio-Safe Coomassie Stain用戶需備有加樣槍及Tip頭、磁力攪拌器、pH計、微波爐、脫色水平搖床等如自行準備SDS PAGE試劑須備有甲叉（161-0201）、丙烯酰胺試劑（161-0101）、Tris（161-0719）、SDS（161-0301）、TEMED（161-0801）、過硫酸氨（161-0700）、甘氨酸（161-0718）（Bio-Rad產(chǎn)品或進口產(chǎn)品），考染染料（Coomassie Brilliant Blue R-250, 10 g（161-0400）或Coomassie Brilliant Blue G-250, 10 g（161-0406）和脫色液Mili Q純水約2L左右五 儀器清點（Protean IEF, Mini Protean 3, Protean II XL）Protean IEF CellPROTEAN IEF等電聚焦電泳槽是PROTEAN IEF系統(tǒng)的核心部分， PROTEAN IEF電泳槽是IPG膠條電泳的專用設(shè)備。它具有以下特點： 高通量，可容納24 根7 cm 膠條或12 根11 cm、17 cm、18cm 和24 cm 膠條。 大范圍的工作溫度（10-25） 內(nèi)置10,000 V 高壓, 2.4 mA 電流的電源完整的PROTEAN IEF（165-4000）包括以下組件，用戶可以根據(jù)自已實驗的需要選擇相關(guān)組件1 主機PROTEAN IEF cell PROTEAN IEF電泳槽 （標配）2 聚焦盤應(yīng)用于水化上樣，適用于大部分蛋白，每個聚焦盤可對1-12膠條進行聚焦7cm focusing tray 7 cm聚焦盤（標配）11cm focusing tray 11cm聚焦盤（標配）17cm focusing tray17 cm聚焦盤（標配）3 水化/平衡盤7,11,17, rehydration/ equilibration trays 7,11,17,水化/平衡盤 25 個4 Forceps and cleaning brushes鑷子和清洗刷5 Mineral oil礦物油6 Electrode wicks電極濾片選配18cm focusing tray18 cm聚焦盤24cm focusing tray24 cm聚焦盤Cup loading tray with movable electrodes帶有可移動電極的杯上樣聚焦盤Sample cups 樣品杯凝膠盤規(guī)格 7 cm 11 cm17 cm18 cm 24 cm 聚焦盤電極間距離 6.5 cm 10.2 cm 16.2 cm17.1 cm 22.7 cm可容納的膠條長度 8.2 cm 12.1 cm18.1cm20.1 cm25.3 cmReadyStripTM IPG膠條長度7.9 cm 11.8 cm 17.8 cm 19.0 cm 24.7 cm水化/平衡盤 可容納的膠條長度 8.0 cm12.7cm 18.6 cm 20.4 cm 25.3 cm最大容積 3.5 ml 6.0 ml 7.5 ml 8.0 ml 12.0 mlMini-PROTEAN 3 電泳槽165-3301 Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell, 10-well, 0.75 mm thickness; complete system, includes 2 combs, 5 sets of glass plates, casting stand, casting clamp assembly, sample loading guide, electrophoresis module (electrode assembly, clamping frame, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam)大型PROTEAN II xi 和XL 電泳槽165-3188 PROTEAN II XL Cell, wide-format, 1.0 mm, includes PROTEAN II xi basic unit (165-1834) and 1.0 mm IPG conversion kit (165-3183)165-1834包括以下部分：1. 電泳槽及蓋(Tank and lid)，各1個2. 中央制冷芯(Central cooling core)，共1個3. 托架（黑色） (Latch (black)，共1個4. 灌膠架(Casting stand)，共1個165-3183的IPG轉(zhuǎn)化套件可將普通的PROTEAN II xi轉(zhuǎn)化為可以做雙向膠的PROTEAN II XL，包括以下部分： 寬的上槽密封墊 (2個) 20 cm 玻璃板 (2套，長、短玻璃板各2塊) 20 cm 三明治夾(Sandwich clamps)，兩對，共4個 灌膠架密封墊片（Replacement Gasket, Casting stand），共2個 膠板對位卡(Alignment card)，2個 窄邊封邊墊條 (4) 2D電泳梳 (2)六. 儀器開機檢查1 IEF主機通電檢查，如屏幕顯示如下，則為正常 BIO-RAD LABORATORIESPROTEAN IEF CELLFIRMWARE VERSION 1.40SYSTEM INITIALIZATION 之后，屏幕會顯示如下REHYDRATION PRESET METHOD STORED METHOD NEW METHOD 2 電源開機通電檢查（以PowerPac Universal為例）之后，屏幕會顯示如下3 檢查其他儀器配件是否齊全，并填寫安裝報告。4 培訓(xùn)結(jié)束后，請老師簽字。七. 概述蛋白質(zhì)組雙向電泳蛋白質(zhì)組簡介蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是以基因組所表達的全部蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)組（Proteome）為研究對象的科學(xué)?；罴毎纳鼱顟B(tài)會受許多因素的影響而發(fā)生改變，胞內(nèi)蛋白質(zhì)在質(zhì)或量上的變化是產(chǎn)生這種現(xiàn)象的重要機制，而目前不管是用在基因組水平、還是在轉(zhuǎn)錄組水平上得到的結(jié)果，都不足以對這種變化進行準確的描述。采用蛋白質(zhì)組分析方法，不但可以確定在導(dǎo)致這種變化的過程中，究竟有哪些蛋白質(zhì)在表達、其表達量如何、以及有沒有翻譯后修飾等特征，而且可以通過將同種生物的二種或多種不同狀態(tài)的細胞 (正常與病態(tài))樣品進行比較，來識別出那些在質(zhì)和量上發(fā)生特異性改變的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組分析的一個最大的問題，是如何實現(xiàn)復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品處理時的高度重復(fù)性和穩(wěn)定性，即樣品處理過程不能改變其組分發(fā)生質(zhì)和量的改變。雙向電泳（2-D PAGE）技術(shù)可以在一塊凝膠上分辨出1,800多個蛋白質(zhì)點(Choe and Lee 2000)，能同時分析成百上千的基因表達產(chǎn)物，非常適于平行分析大量蛋白質(zhì)的分離，因此成為目前蛋白質(zhì)組研究中解決上述難題的首要方法(Cutler et al. 1999, Fegatella et al. 1999, Gorg et al. 2000)。將雙向電泳后的凝膠圖像結(jié)果，通過相應(yīng)的圖像掃描儀成像后，借助專門的軟件對之進行分析，得到的各研究小組間的實驗數(shù)據(jù)資料可以進行進一步的編錄和比較。實驗設(shè)計思路下圖簡示了蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的基本實驗設(shè)計思路，并對該實驗流程進行簡要的說明。蛋白的發(fā)現(xiàn)生物信息學(xué)質(zhì)譜蛋白消化蛋白切取成像和分析雙向電泳生物樣品樣品制備生物學(xué)問題圖1.2蛋白質(zhì)組學(xué)實驗設(shè)計思路八. 雙向電泳實驗流程樣品制備樣品制備是實驗成敗的關(guān)鍵，其具體的方法依據(jù)不同的研究目的來確定。樣品制備的影響因素包括感興趣蛋白質(zhì)的溶解性、分子量、電荷數(shù)及等電點等。用于樣品處理的緩沖液必須在低離子強度的基礎(chǔ)上，既能保持蛋白質(zhì)的天然電荷，又能維持其溶解性。(詳見 “雙向電泳實驗指南”第二,第九章)第一向分離在第一向分離中蛋白質(zhì)先按其等電點（isoelectric point pI值）分開。pI值就是使蛋白質(zhì)不帶凈電荷，且在電場中不發(fā)生遷移的特定pH值。這項將蛋白質(zhì)按其等電點分離的技術(shù)稱為等電聚焦（IEF）。對雙向電泳來說，等電聚焦最好是在一個固定pH梯度的凝膠（IPG）中運行。(詳見 “雙向電泳實驗指南”第三,第十章)平衡膠條由第一向轉(zhuǎn)移到第二向之前，需要先進行平衡。這一過程包括蛋白質(zhì)二硫鍵的還原、半胱氨酸殘基的烷基化，以及樣品與SDS結(jié)合為第二向根據(jù)分子量(MW)的分離做準備等過程。(詳見 “雙向電泳實驗指南”第四,第十章)第二向分離對第二向聚丙烯酰胺凝膠與單向的聚丙烯酰胺凝膠電泳一樣,根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的范圍來分離蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)組研究中，需要在同樣的條件下同時走多塊膠，這對凝膠與凝膠之間的比較十分重要。(詳見 “雙向電泳實驗指南”第四,第十章)染色凝膠染色的目的是使其中的蛋白質(zhì)能夠被觀察到。目前還沒有通用的染色方法，只能在考慮多種因素如需要的靈敏度、線性范圍、方便程度、費用、以及成像設(shè)備的類型等基礎(chǔ)上，結(jié)合自己的實際進行選擇。有時也可以將蛋白轉(zhuǎn)膜后通過免疫印跡的方法來進行檢測。(詳見 “雙向電泳實驗指南”第五,第十二章)成像成像設(shè)備可以攝入圖像，對凝膠圖像以數(shù)字形式保存，對每塊凝膠圖像進行平等的比較，在各研究組之間傳遞信息，并且對大量的數(shù)據(jù)進行歸類分析。各種類 型的成像設(shè)備配有相應(yīng)的分析軟件，可以特異地收集、詮釋、比較蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)資料等。(詳見 “雙向電泳實驗指南”第五,第十二章)軟件分析 Bio-Rad的PDQuestTM軟件，可以對凝膠的圖像進行比較分析、蛋白質(zhì)點注釋、數(shù)據(jù)歸類分析，還可以操縱Bio-Rad各種成像儀器以及蛋白切取工作站(ProteomeWorksTM )，并對蛋白組研究中產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)資料進行比較。(詳見 “雙向電泳實驗指南”第七章)蛋白鑒定一旦通過差異分析或其它方法找到感興趣的蛋白后，就可以從凝膠中切取這些蛋白質(zhì)作鑒定。借助質(zhì)譜分析，可以精確的測定蛋白質(zhì)的分子量，并且通過數(shù)據(jù)庫檢索找到匹配的肽段。EQUest Spot Cutter全自動切膠系統(tǒng)可以將感興趣的蛋白質(zhì)點從凝膠上自動精確的切割下來，并將這些切割下來的蛋白點對應(yīng)的轉(zhuǎn)移到96孔微孔板中。這個蛋白切取工作完全可以用PDQuest軟件控制所有的操作。對切割下來的蛋白質(zhì)，可以送到質(zhì)譜分析中心，中心會對這些蛋白點進行脫色、蛋白降解，然后進行生物質(zhì)譜分析?？梢杂肕ALDI質(zhì)譜儀進行肽質(zhì)量指紋譜的自動分析。對于MALDI無法鑒定的蛋白質(zhì)，可以用Q-Tof電噴霧 LC-MS-MS 工作站進行序列標簽鑒定或進行蛋白質(zhì)測序。九. 2D Start Kit簡介本實驗培訓(xùn)使用ReadyPrep 2-D Starter Kit(雙向電泳啟動試劑盒)，是為初次進行雙向電泳操作設(shè)計,試劑包含一整套經(jīng)測試的預(yù)混試劑,通過實驗用戶可掌握雙向電泳實驗技術(shù)要點,以便進一步開展研究工作。試劑盒中含以下內(nèi)容: E. coli 蛋白樣品， 2.7 mg ReadyPrep 雙向電泳啟動試劑盒再水化/樣品緩沖液， 10 ml 1該標準配方適合許多蛋白樣品；經(jīng)性能測試的緩沖液能方便地用于制備樣品。8 M urea, 2% CHAPS, 50 mMDTT, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholytes, Bromophenol Blue ReadyPrep 平衡緩沖液I，20 ml 220 ml of 6 M urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 20% glycerol, and 2% (w/v) DTT ReadyPrep 平衡緩沖液II，20 ml 220 ml of 6 M urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), and20% glycerol.(使用時需加碘乙酰胺使之終濃度為2.5%) 30% 甘油溶液，70 ml 1 ReadyPrep 覆蓋瓊脂糖溶液，50 ml 1 碘乙酰胺,0.5 g 2 超純水，15 ml 1不同膠條長度實驗時間，本實驗是7cm十. 雙向電泳演示實驗操作步驟(一) 樣品制備及及等電聚焦1. 從冰箱中取出4保存的雙向電泳啟動試劑盒。2. 在上樣緩沖液干粉瓶中加入6.1ml去離子水，使之溶解后，吸取2ml溶解后緩沖液，加入到E.coli蛋白樣品瓶中，制成濃度為1.35mg/ml的蛋白質(zhì)樣品。雙向電泳上樣3. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。附:IPG膠條蛋白質(zhì)載樣量（考馬氏亮藍R-250）膠條長度加樣體積樣品蛋白量7 cm125 ul169 ug11 cm185 ul250 ug17 cm300 ul405 ug4. 取出-20冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（7cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。而后，用鑷子去除IPG膠條上的保護層。5將IPG膠條膠面朝下置于樣品溶液上，膠條的正極（標有+）對應(yīng)于聚焦盤的正極并與電極緊密接觸，不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。6. 在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油(根據(jù)不同膠條長度,本實驗1.5ml)，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。7. 對好正、負極，蓋上蓋子。將聚焦槽水平放入等電聚焦儀中，設(shè)置等電聚焦程序。 7cm膠條水化12小時（18）主動水化（50V）或被動水化S1250V線性30分鐘除鹽S2500V快速30分鐘除鹽S34000V線性3小時升壓S44000V快速20,000伏小時聚焦S5500V快速任意時間保持選擇所放置的膠條數(shù)。設(shè)置每根膠條的極限電流。（50mA/根）設(shè)置等電聚焦時的溫度。（20）11cm膠條水化12小時（20）主動水化（50V）或被動水化S1250V線性30分鐘除鹽S21000V快速30分鐘除鹽S38000V線性4小時升壓S48000V快速40,000伏小時聚焦S5500V快速任意時間保持選擇所放置的膠條數(shù)。 設(shè)置每根膠條的極限電流。（50mA/根）設(shè)置等電聚焦時的溫度。（17）17cm膠條水化12小時（20）主動水化（50V）或被動水化S1250V線性30分鐘除鹽S21000V快速1小時除鹽S310000V線性5小時升壓S410000V快速60,000伏小時聚焦S5500V快速任意時間保持選擇所放置的膠條數(shù)。設(shè)置每根膠條的極限電流。（50mA/根）設(shè)置等電聚焦時的溫度。（20）8.聚焦結(jié)束的膠條，立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20冰箱保存。聚焦結(jié)束后的膠條如果直接染色見下圖。請注意正極位置有+，當(dāng)所印字為正常時，該面為支撐膜面，面下為膠面。（二）第二向SDS-PAGE電泳Mini Protean III組裝灌膠1. 配制12%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配12ml凝膠溶液，每塊凝膠6ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留約1cm的空間，用MilliQ水或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合45分鐘。(7cm膠條)4%7.5%12%X%30% Acrylamide/Bis0.5 M Tris-HCl,3.3 ml25 ml40 ml(4.8 ml*)3.3(X%) = (A)* mlpH 6.81.5 M Tris-HCl,6.3 mlpH 8.825 ml25 ml(3 ml)25 ml10% SDSDistilled deionized250 l1.0 ml1.0 ml(0.12 ml)1.0 mlwater15 ml48.5 ml33.5 ml(4.02ml)73.5 - (A)*TEMED25 l50 l50 l(6 ul)50 l10% APS125 l500 l500 l(60 ul)500 lTotal volume25 ml100 ml100 ml(12 ml)100 ml*字母A 是指配制特定膠濃度(X%)所需的30% Acrylamide/Bis 溶液的體積 * 本次實驗中請按12%膠一欄中括號里的黑體部分的數(shù)字進行配制。本表所采用的試劑如下：161-015730% Acrylamide/Bis Solution, 29:1, 2500ml預(yù)混合制膠液161-0700Ammonium Persulfate, 10 g161-0801TEMED, 50 ml161-0700Ammonium Persulfate, 10 g161-0798Resolving gel buffer, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 1 L161-0416SDS Solution, 10 % (w/v ), 250 ml如未采用Bio-Rad的預(yù)混合制膠液而自行配制，請參閱第21頁附錄的聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的配方2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。 平衡3. 從-20冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10-15分鐘平衡。4. 配制膠條平衡緩沖液I，在平衡緩沖液I、II干粉中各加入13.35ml 30%的甘油，在平衡緩沖液II中加入碘乙酰胺，充分混勻。5在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時出現(xiàn)的縱條紋。6. 將膠條膠面朝上轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，并加入根據(jù)膠條長度加入平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上平衡15分鐘。加樣量見下表: 7. 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。8. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。轉(zhuǎn)移和電泳9.將低熔點瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。10.將10電泳緩沖液稀釋成1電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。11.第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，并完全浸末在1電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。15.用鑷子輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡。16.而后在IPG膠條上注入低熔點瓊脂糖，待低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。17.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，第一種程序為起始時低電流（5mA/gel/7cm），待樣品在完全走出IPG膠條，再加大電流至（15-20mA/gel/7cm），第二種程序為開始時80V約5分鐘，以后200V，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。18.電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號。19.進行染色。(三) Bio-Safe考馬斯亮蘭染色Bio-Safe 膠體考馬斯蘭是一種預(yù)制的染色溶液，它的敏感度介于Coomassie Blue R-250和銀染之間。1. 用去離子水清洗凝膠三次，每次10分鐘，以去除SDS。2. 加入足夠的Bio-Safe Coomassie stain覆蓋凝膠，搖蕩1小時至過夜。1小時后顏色會逐漸加深。3. 在搖蕩下用去離子水清洗凝膠，直到得到理想的對比度。（四）染色后圖像掃描 以GS800為例，簡要說明凝膠圖像掃描 過程： 先開啟掃描儀，再開計算機。 將凝膠置于掃描儀上，用純水小心潤濕 膠與掃描儀儀玻璃板之間，使之沒有氣泡。 并用濾紙小心吸干凝膠周圍的水分。 蓋上上蓋，準備進行掃描1 進行預(yù)掃(Prescan)，確定掃描范圍2 調(diào)整掃描窗口大小3.進行掃描4保存文件（如是別的掃描儀，請保存為TIFF文件格式）5掃描結(jié)束后，先用濾紙小心吸干大部分水分，再以棉球或鏡頭紙小心擦拭鏡面。晾干后合上掃描儀蓋子。6關(guān)閉掃描儀電源。電泳結(jié)果圖（五）進行軟件分析（見PDQuest培訓(xùn)教程）（六）功能研究1已知蛋白，已有抗體，可進行Western Blotting。推薦采用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)進行半干轉(zhuǎn)印或是轉(zhuǎn)印槽進行濕轉(zhuǎn)。推薦采用化學(xué)發(fā)光的方法進行，可選用Chemi Doc XRS進行成像2蛋白分子量已知，可采用Experion全自動快速電泳系統(tǒng)進行快速檢測3多種抗體，可采用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)進行精確檢測，并可做蛋白分子間相互作用的檢測附1實驗注意事項1.雙向電泳中所用的化學(xué)試劑純度要高，至少為分析級。盡量選用進口試劑。2.雙向電泳中使用MilliQ水（電導(dǎo)小于1mS）。3.所有包含尿素的溶液加熱溫度不超過30，否則會發(fā)生蛋白氨甲酰化（一）等電聚焦1. 配好的尿素儲液必須馬上使用，或用mixed-bed離子交換樹脂，清除長時間放置時尿素溶液中形成的氰酸鹽，預(yù)防蛋白質(zhì)的甲?；?。2. 將水化上樣緩沖液分裝后再儲存于-20。用時，只要解凍需要量，其余繼續(xù)儲存。水化上樣緩沖液一旦溶解不能再冷凍。3. 將水化上樣緩沖液加入蛋白樣品中，終溶液中urea的濃度需6.5M。4. 等電聚焦溶脹緩沖液和樣品溶液中都要加入兩性電解質(zhì)，它能夠幫助蛋白質(zhì)溶解。兩性電解質(zhì)的選擇取決于IPG膠條的pH范圍。下圖可提供參考。IPGpH RangeBio-Lyte Ampholyte(Stock)Range Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 5ml per50ml3-103-1040%25ul250ul4-74-640%12.5ul125ul5-740%12.5ul125ul3-63-520%25ul250ul4-640%12.5ul125ul5-85-840%25ul250ul7-107-940%12.5ul125ul8-1020%25ul250ul5. 下表顯示的是通常推薦使用的雙向電泳第一向蛋白上樣量。因為樣品和樣品之間存在差異，所以這種上樣量僅提供參考。對于窄pH范圍的IPG膠條，需要比寬pH范圍的IPG膠條上更多的樣品，這是因為pI值不在此范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)在等電聚焦的過程中會走出膠條。單pH范圍IPG膠條的上樣量是通常的4-5倍還多，這樣就可以很好的檢測低豐度的蛋白質(zhì)。IPG膠條的長度分析型的上樣量（銀或SYPRO Ruby染色）制備型的上樣量（考馬斯亮藍染色）7 cm10-100ug蛋白200-500ug蛋白11cm50-200ug蛋白250-1,000ug蛋白17cm100-300ug蛋白1-3mg蛋白6. 樣品溶液的上樣體積見下表。這樣就可以使膠條溶脹至它們原來的厚度（0.5mm）。膠條最少需要經(jīng)過11小時的溶脹。即使看上去所有的緩沖液都已經(jīng)被吸收，也一定要確保膠條在槽中溶脹充分的時間。只有在IPG凝膠的孔徑已經(jīng)溶脹充分后，才可以吸收大分子量蛋白質(zhì)，否則大分子量蛋白質(zhì)無法進入膠條。ReadyStripTM IPG膠條的長度上樣體積7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul7. 如果在等電聚焦過程中，聚焦盤中還有很多的溶液沒有被吸收，留在膠條的外面，這樣就會在膠條的表面形成并聯(lián)的電流通路，而在這層溶液中蛋白質(zhì)不會被聚焦。這就會導(dǎo)致蛋白的丟失或是圖像拖尾。為了減少形成并聯(lián)電流通路的可能性，可以先將膠條在溶脹盒中進行溶脹，然后再將溶脹好的膠條轉(zhuǎn)移到聚焦盤中。在轉(zhuǎn)移過程中，要用濕潤的濾紙仔細地從膠條上吸干多余的液體。8. 帶上手套用鑷子去除IPG膠條上的保護層。將IPG膠條仔細的置于溶脹緩沖液上，膠面朝下，確保整個膠面都能被浸濕。9. 在樣品溶液中加入痕量的溴酚藍對觀察溶脹過程很有幫助。在覆蓋礦物油之前，可以讓膠條先吸收1小時的液體。IPG膠條上一定要覆蓋礦物油，否則緩沖液會蒸發(fā)，使得溶液濃縮，導(dǎo)致尿素沉淀。作為防止緩沖液蒸發(fā)的預(yù)防措施，礦物油必須緩緩地加在每個槽內(nèi)，確保完全的覆蓋住每一根膠條。10. 下面的表格給出了建議使用的IPG膠條運行的總volt-hours。這僅提供參考，不同的樣品需要的volt-hours不同。當(dāng)聚焦過程無法達到最高電壓時，只要最后能達到總的volt-hours，且7cm膠條電壓不低于3000伏，11cm膠條電壓不低于5000伏，17cm膠條電壓不低于7000伏，也能對樣品進行充分的聚焦。ReadyStrip IPG膠條的長度最高電壓建議的Volt-Hours7 cm8,000V8,000-10,000V-hr11cm8,000V20,000-40,000V-hr17cm10,000V30,000-60,000V-hr11. 為使樣品進入膠的效率增加，采用50V低電壓溶脹；繼續(xù)以低電壓梯度（200V，500V，1000V各一個小時）進行電泳，最后達到10000V進行聚焦。12. 處理預(yù)制IPG膠條時，一定要始終帶著手套。注意預(yù)防角蛋白污染。13. 水化上樣緩沖液的成分由不同的樣品決定。14. 每根膠條蛋白質(zhì)的總上樣量由特定的樣品，膠條的pH范圍，及最終的檢測方式?jīng)Q定。下表是進行銀氨染色時的蛋白質(zhì)上樣參考。ReadyStrip7cm11cm17cm3-105-100ug20-200ug50-300ug4-710-150ug40-200ug80-300ug3-610-150ug40-200ug80-300ug5-810-150ug40-200ug80-300ug7-1020-200ug50-300ug100-300ug15. 所有包含尿素的溶液加熱溫度不超過30，否則會發(fā)生蛋白氨甲?；?。引起蛋白質(zhì)pI值的偏移。16.主動水化過程，會幫助大分子量的蛋白質(zhì)進入膠條，但會丟失部分小分子量蛋白。17.當(dāng)樣品中含鹽量較高時，建議選用慢速升壓。當(dāng)樣品中含鹽量一般時，選用線性升壓。當(dāng)樣品中含鹽量很少時，可以選用快速升壓，這樣可以節(jié)省聚焦時間。18.雖然儀器中每根膠條的極限電流可以設(shè)為99mA/根。但一般膠條的極限電流不超過50mA/根。19.可以在聚焦盤或水化盤的兩端電極處搭上鹽橋，這可以幫助除鹽。但需注意的是，鹽橋必須是濕潤的但水不能太多，必要時需用濾紙吸去多余的水份。保持鹽橋與電極的緊密接觸。20. 程序設(shè)置中的除鹽步驟，可根據(jù)具體情況進行設(shè)置，如果樣品中含鹽量較高可設(shè)置多步除鹽，并加長除鹽時間。但這種方法只能除去很少量的鹽離子，所以最好是在上樣前，對樣品進行除鹽處理。 （二）膠條的平衡1.不同長度的膠條，選用不同體積的膠條平衡緩沖液?？蓞⒖枷卤怼Ｄz條的長度7cm11cm17cm膠條平衡緩沖液I2.5ml4ml6ml膠條平衡緩沖液II2.5ml4ml6ml2. 從冰箱中取出得膠條一定要先解凍。3. 膠條平衡緩沖液I和膠條平衡緩沖液II都要現(xiàn)配，因為DTT和碘乙酰胺在室溫的半衰期很短。4. 平衡過程導(dǎo)致蛋白丟失約5%-25%，還會使分辨率降低，平衡30分鐘時，蛋白帶變寬40%，所以平衡時間不可過長。如果不經(jīng)平衡，把等電聚焦凝膠直接放在第二向凝膠上會導(dǎo)致高分子量蛋白的紋理現(xiàn)象，并且等電聚焦凝膠會粘在SDS膠上。縮短平衡時間可以減少擴散，但同時會減少向第二向的轉(zhuǎn)移。所以平衡時間要充分長（至少210分鐘），但也不要超過（215分鐘）。5平衡緩沖液包括Tris-HCl（pH8.8），SDS（2%），高濃度尿素（6M）和甘油（20%）提高蛋白的溶解度并減少電內(nèi)滲。第一部加入DTT（1%）是為了使蛋白去折疊；第二步加入碘乙酰胺是為了去除多余的DTT（銀染過程中，DTT會導(dǎo)致電脫尾）。6.對于非常疏水的蛋白或含有二硫鍵的蛋白，相對于DTT和碘乙酰胺，TBP（tributylphosphine）更有效。（三）膠條的轉(zhuǎn)移1在瓊脂糖中加入少量的溴酚藍，可以觀察到電泳的進程。2瓊脂糖的溫度不能太高，熱的瓊脂糖會加速平衡緩沖液中尿素的分解。3當(dāng)用瓊脂糖覆蓋膠條時，常會在膠條的下面或背面形成氣泡。這些氣泡會干擾蛋白質(zhì)的遷移，所以必須去除。通常在剛加入瓊脂糖后，趕快用鑷子、壓舌板或平頭針頭輕壓膠條塑膠支撐膜的上方，驅(qū)趕氣泡。4如果選用的是普通瓊脂糖，先將膠條推進玻璃板中，使之與第二向凝膠緊密接觸，然后再加入瓊脂糖封膠液。這是因為普通瓊脂糖熔點較高，凝固較快。（四）SDS-PAGE凝膠電泳1玻璃板一定要清洗干凈，否則在染色時會有不必要的凝膠背景。2過硫酸銨（Ap）要新鮮配制。40%的過硫酸銨儲存于冰箱中只能使用2-3天，低濃度的過硫酸銨溶液只能當(dāng)天使用。3蛋白質(zhì)從一向（IPG膠條）到二向（SDS凝膠）的轉(zhuǎn)移為避免點脫尾和損失高分子量蛋白，應(yīng)緩慢進行（場強小于10V/cm）。4. 用Mini Protein 3電泳槽時，以電流為標準，開始進樣的低電流為5mA/gel，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，再加大電流到10-15mA/gel；以電壓為標準，開始進樣的低電壓為50-75V/gel，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，再加大電壓到150-200V /gel。用Protein II電泳槽時，以電流為標準，開始進樣的低電流為10mA/gel，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，再加大電流到20-30mA/gel；以電壓為標準，開始進樣的低電壓為75-100V /gel，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，再加大電壓到300-400mA/gel。附2 聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的配方表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液溶液成分不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）51015202530405012% 水1.63.34.96.68.29.913.216.5 30%丙烯酰胺溶液246810121620 1.5 mol/L Tris (pH8.8)1.32.53.856.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%過硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0230% 聚丙烯酰胺貯液丙烯酰胺150g甲叉雙丙烯酰胺4gMilliQ水500ml濾紙過濾后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris堿 pH8.8Tris堿90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HCl調(diào)pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。10% SDSSDS10gMilliQ水100ml混勻后，室溫保存。10% ApAp0.1gMilliQ水1ml（用時加水溶解）溶解后，4冰箱保存。10電泳緩沖液（1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris堿30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混勻后，室溫保存。十一. IEF使用過程中常見問題及解決方法以下為IEF在使用過程中可能會碰到的問題，詳細情況請閱讀說明書。如果操作錯誤或系統(tǒng)錯誤時，相應(yīng)的錯誤信息會顯示在液晶屏上。同時系統(tǒng)的電源供應(yīng)會在錯誤信息顯示時自動切斷。問題可