第二章植物新品種來源.ppt

1,第二章 植物新品種來源,第一節(jié) 植物的繁殖方式與品種類型 第二節(jié) 種質(zhì)資源 第三節(jié) 引種與馴化 第四節(jié) 現(xiàn)代育種目標(biāo)與方法,2,第一節(jié) 植物的繁殖方式與品種類型,一、有性繁殖 （一）花器官構(gòu)造,3,兩性花（完全花、雌雄同花），如小麥、水稻、油菜,4,單性花 同株異花（monoecious)：玉米 雌雄異株（dioecious）：大麻、菠菜 有的植物既有完全花、又有單性花: 天竺葵,雌花 雌雄同花,5,（二）花序 無限花序：（總狀花序類）開花順序自下而上，或自外而內(nèi)。,6,總狀花序,小花梗近等長，排列在花序軸的兩側(cè)。,7,傘形花序,小花梗等長，著生在花序軸的頂端。,8,傘房花序,小花梗不等長，排列在近同一平面上,9,穗狀花序,小花無梗，排列在花序軸的兩側(cè),10,葇荑花序,小花為無柄的單性花，常無花被，花須常下垂,11,肉穗花序,花序軸粗短而肥厚，上著生無柄單性花,12,頭狀花序,花序軸扁平，稱花序盤，開花順序從外至內(nèi),13,圓錐花序,復(fù)合花序的種類： 圓錐花序 復(fù)穗狀花序 復(fù)傘形花序 復(fù)傘房花序 復(fù)頭狀花序,14,復(fù)傘形花序,15,有限花序：開花順序自上而下或自內(nèi)而外。 1、單歧聚傘花序：主軸頂端先生一花，然后在主軸下方形成一側(cè)枝，同樣在頂端開花，依次下去。又可分為蝎尾狀聚傘花序和卷傘花序（螺狀聚傘花序）。 2、二歧聚傘花序：主軸下形成兩分枝。 3、多歧聚傘花序：分枝在三個以上。,16,多歧聚傘花序,單歧聚傘花序,17,輪傘花序,18,（三） 開花傳粉,1、開花：雄蕊內(nèi)的花粉囊和雌蕊中的胚囊（或二者之一） 成熟時，花被展開，露出雄蕊和雌蕊。 2、傳粉：開花后，花粉囊散出花粉，落在雌蕊柱頭上的 過程。 3、傳粉方式：自花傳粉、異花傳粉。 4、植物對異花傳粉的適應(yīng)：單性花； 雌雄蕊異熟； 雌雄蕊異位； 雌雄蕊異長；自花不孕,19,5、風(fēng)媒花和蟲媒花 風(fēng)媒花：風(fēng)媒植物的花常成穗狀花序、葇荑花序；能產(chǎn)生大量花粉。花粉質(zhì)輕、干燥、表面光滑，常為雌雄異花或異株，不具香味和色澤。 蟲媒花：常能產(chǎn)生特殊氣味吸引昆蟲；常產(chǎn)生蜜汁；花大而顯著，花粉外壁粗糙。 6、其它傳粉方式：如水媒和鳥媒；人工輔助授粉。,20,21,22,23,（四）受精 1、花粉粒的萌發(fā) 花粉管落在雌蕊柱頭上，經(jīng)過與雌蕊柱頭相互識別，親和的開始吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)，體積增加，花粉粒的內(nèi)壁從萌發(fā)孔處 伸出，形成花粉管。 2、花粉管的伸長 花粉管在萌發(fā)后，繼續(xù)伸長，通過花柱到達(dá)子房，通 過花柱時，可能有以下幾種可能： 1）穿過中空的花柱道； 2）花柱內(nèi)有引導(dǎo)組織； 3）花粉管通過花柱薄壁細(xì)胞的間隙或細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的間隙穿過。,24,1） 概念： 精細(xì)胞（n）+卵細(xì)胞（n） 合子（2n） 精細(xì)胞（n）+2個極核（n） 初生胚乳核（3n） 2） 過程： 不管花粉管如何進(jìn)入胚珠，總是從珠孔端進(jìn)入胚囊。并且花粉管進(jìn)入總與助細(xì)胞有關(guān)。花粉管進(jìn)入胚囊后，管的末端破裂，把精細(xì)胞和內(nèi)容物注入進(jìn)胚囊。兩個精細(xì)胞游離到卵細(xì)胞和中央細(xì)胞，與它們?nèi)诤稀?3、被子植物的雙受精,25,柱頭,子房,極核,卵細(xì)胞,花柱,反足細(xì)胞,助細(xì)胞,26,花粉粒的識別,27,花粉管的伸長,28,雙受精的過程,29,融合后的合子和初生胚乳核,30,（五）有性繁殖（小結(jié)） 1、自花授粉作物（50%）: 玉米、甘薯、白菜型油菜； 3、常異花授粉作物（5-50%）: 棉花、甘藍(lán)型油菜、高粱、蠶豆等； 4、自交不親和性（self-incompatibility）：十字花科、煙草、甘薯、向日葵等； 5、雄性不育性（male sterility)：（核不育 genic male sterility (gms)、胞質(zhì)不育cytoplasmic male sterility (cms)）；玉米、高粱、水稻、棉花、小麥 等,31,自交不親和性機理 十字花科、煙草、甘薯、向日葵等,32,二、無性繁殖 （一）營養(yǎng)體繁殖 1、主要作物: 甘薯（塊根）、馬鈴薯（塊莖）、甘蔗（莖）； 2、果樹花卉的嫁接； 3、組織與細(xì)胞培養(yǎng)再生植株； 4、由營養(yǎng)體繁殖的后代統(tǒng)稱為無性系（clone）。,33,園藝植物用于繁殖的各種特化營養(yǎng)器官,34,（二）無融合生殖 1、二倍體孢子生殖(2n)：大孢子母細(xì)胞有絲分裂形成二倍體胚囊 2、無孢子生殖(2n)：胚珠體細(xì)胞發(fā)育形成二倍體胚囊 3、不定胚生殖（2n)：胚珠或子房壁二倍體細(xì)胞經(jīng)有絲分裂形成胚，同時正常胚囊中的極核發(fā)育成胚乳 4、孤雌生殖(1n)：卵細(xì)胞不受精直接形成單倍體胚 5、孤雄生殖(1n)：進(jìn)入胚囊的精核未與卵細(xì)胞融合而直接發(fā)育成單倍體胚。,35,三、果實的形成和類型 （一）果實的形成 1、 真果：完全由子房形成的果實。 2、 假果：除子房外，花的其它部分參與形成果實。 （二）單性結(jié)實和無籽果實 子房不經(jīng)過受精而形成果實，稱為單性結(jié)實。 單性結(jié)實的果實為無籽果實。,36,（三）果實的類型 1.單果 2.聚合果：由花內(nèi)離生單雌蕊形成的果實。 3.復(fù)果（聚花果）：由花序形成的果實。,肉質(zhì)果 干果,漿果： 核果： 梨果：,裂果類：莢果；蓇葖果；角果；蒴 果。 閉果類：瘦果；穎果；翅果；堅果； 雙懸果；胞果。,37,肉質(zhì)果,38,漿果：由一至多心皮形成的最常見的一種肉質(zhì)果。,39,40,漿果,41,42,瓠果：葫蘆科植物的果實，由下位子房和花托共同形成。,43,柑果：柑橘類的特殊果實，具中軸胎座，多心皮。,44,柑果,45,核果：單雌蕊形成的果實，內(nèi)果皮堅硬。,46,梨果：下位子房與托杯共同形成的果實。,47,48,干果,49,莢果：一心皮子房，成熟時沿背、腹兩條縫線開裂。,50,51,蓇葖果：一心皮子房，成熟時沿一條縫線開裂。,52,角果：2心皮子房，果實成熟后沿腹縫線開裂。種子著生在中央假隔膜上。,53,蒴果,54,蒴果：多心皮子房，成熟時各種開裂方式。,55,瘦果：13心皮子房，果內(nèi)含1枚種子。,56,穎果：2心皮果實，果皮與種皮愈合。,57,翅果：果皮延伸成翅狀。,58,堅果：外果皮堅硬，含一粒種子。,59,聚合果,60,61,復(fù)果,62,63,四、品種類型,（一）同質(zhì)純合型 1、純系品種：自花授粉植物育成的品種 2、自交系：異花授粉植物自交選育出的培育雜交一代的新材料 (inbred line) （二）同質(zhì)雜合型 1、雜種一代(hybrid cultivar)：個體之間基因型相同，但都高度雜合。 2、營養(yǎng)系品種(cloned cultivar)：由無性繁殖而成的品種。比如紅富士，1951年盛岡支場選出，1962年定名，推廣到全世界，但任何一個個體都來自源株(orter)器官的延伸，都基本保持原株的基因型。,64,（三）異型純合型 1、雜交合成群體(composite cross population)：即多種純合基因型的混合群體，在人工選擇與自然選擇的作用下，逐漸形成一個較穩(wěn)定的群體。 2、多系品種(multiline cultivar)：由若干個農(nóng)藝性狀表現(xiàn)基本一致而抗性基因多樣化的相似品系的混合體。比如近等基因系。 （四）異型雜合型品種 1、自由授粉品種(free cross pollinated cultivar)：在生產(chǎn)與繁殖過程中，品種內(nèi)、植株間自由隨機傳粉，以及與其它品種之間相互傳粉，通過人工選擇，植株間在保存本品種基本特征的基礎(chǔ)上，有一定程度的變異。 2、綜合品種(synthetic cultivar)：多個彼此相似的家系、自交系在隔離條件下隨機交配組成復(fù)雜群體，雙交種、遺傳基礎(chǔ)較廣，對環(huán)境脅迫有較強的適應(yīng)性。,65,（一） 概念 種質(zhì)資源（germpalsm resources）或稱基因資源( gene resources )、遺傳資源( genetic resources ) 。 包含一定的遺傳物質(zhì)，表現(xiàn)一定的優(yōu)良性狀，并能將其遺傳性狀傳遞給后代的植物資源的總和。亦即對植物品種改良和栽培擁有一定利用價值的遺傳物質(zhì)總和。,一、種質(zhì)資源概念及在育種工作中的意義,第二節(jié) 種質(zhì)資源,66,（二） 意義 1、種質(zhì)資源是不斷發(fā)展新植物的主要來源。 2、它是育種工作的物質(zhì)基礎(chǔ)。 3、適應(yīng)生產(chǎn)的不斷發(fā)展，需要發(fā)掘更多的種質(zhì)資源，隨著生產(chǎn)發(fā)展和人類需求水平的提高，對植物育種不斷提出新的要求。,67,二、種質(zhì)資源分布,（一）中國氣候型（大陸東岸氣候型） 1、溫暖型（低緯度地區(qū)） 2、冷涼型（高緯度地區(qū)） （二）歐洲氣候型（大陸西岸氣候型） （三）地中海氣候型,68,（四）墨西哥氣候型 （五）熱帶氣候型 1、亞洲、非洲、大洋洲熱帶著名花卉 2、中美洲、南美洲熱帶著名花卉 （六）沙漠氣候型 （七）寒帶氣候型,69,三、種質(zhì)資源的分類,1、本地種質(zhì)資源 在當(dāng)?shù)氐淖匀缓驮耘鄺l件下，經(jīng)長 期的栽培與選育而得到的植物品種和類型。 2、外地種質(zhì)資源 由國內(nèi)不同氣候區(qū)域或由國外引進(jìn)的植物品種和類型。,70,3、野生種質(zhì)資源 指未經(jīng)人們栽培的自然界野生的花卉植物。 4、人工創(chuàng)造的種質(zhì)資源 指人工應(yīng)用雜交、誘變等方法所創(chuàng)造的育種原始材料。,71,四、種質(zhì)資源的收集,（一)種質(zhì)資源收集原則 1、必須根據(jù)收集的目的和要求，單位的具體條件和任務(wù)，確定收集的對象，包括類別和數(shù)量。 2、收集范圍應(yīng)該由近及遠(yuǎn)，根據(jù)需要先后進(jìn)行，首先應(yīng)考慮珍稀瀕危種的收集，其次收集有關(guān)的種、變種、類型和遺傳變異的個體，盡可能保存生物的多樣性。 3、種苗收集應(yīng)遵照種苗調(diào)拔制度的規(guī)定，注意檢疫，并做好登記、核對，盡量避免材料的重復(fù)和遺漏。,72,研究所基因庫,研究所,計算機化數(shù)據(jù)室,外單位贈送,登記,田間收集,性狀描述,全面評價,增殖,交流,(送長期保存中心),基因庫登記資源評價及操作程序,備份,73,(二 ) 種質(zhì)資源收集范圍 全球植物資源 地區(qū)植物資源 群落內(nèi)植物資源 物種資源（居群） 品種群 單株、器官、組織、單個細(xì)胞、一個基因片斷。,74,五、種質(zhì)資源的保存,種質(zhì)資源的保存方式有以下幾種： 1、自然保存法 2、種植保存法 3、組織培養(yǎng)保存法 4、種子保存法 5、超低溫種質(zhì)保存法,75,六、種質(zhì)資源的研究利用（觀賞園藝植物為例）,1、分類學(xué)性狀的研究 2、生物學(xué)特性的研究 3、經(jīng)濟性狀的研究 4、觀賞特性的研究 5、抗性特點的研究 6、適合能力的研究 7、分子生物學(xué)研究,76,了解中國氣候概況,77,中國植被分布最為集中的地區(qū) 西南山區(qū)：四川、云南、廣西 中南山區(qū)：湖北山區(qū) 東北地區(qū)：大小興安嶺及長白山區(qū),78,中國八大植被區(qū)域： 大興安嶺北部寒溫帶落葉針葉林區(qū)域 東北、華北溫帶落葉闊葉林區(qū)域 華中、西南常綠闊葉林區(qū)域 華南、西南熱帶雨林、季雨林區(qū)域 內(nèi)蒙、東北溫帶草原區(qū)域 西北溫帶荒漠區(qū)域 青藏高原高寒草甸、草原區(qū)域 高寒荒漠區(qū)域,我國觀賞植物原產(chǎn)地,79,中國特有植物,銀杏、水杉 銀杉、珙桐,中國特有種子植物圖譜數(shù)據(jù)庫共收錄我國種子植物特有72科，243屬，529種。圖譜529幅。,80,品種特色突出 品種群豐富 應(yīng)用形式豐富,81,金花茶,毛華菊,82,花團錦簇的山茶花,83,學(xué)名：camellia japonica linn. 英文名：japan camellia 科名：山茶科 theaceae,山茶花,84,花卉育種的寶貴材料,大花黃牡丹,紫斑牡丹,85,86,一、概念 1、引種：引進(jìn)外地或外國的種質(zhì)資源，用途：引種栽培、引種馴化、引種改良。 2、引種栽培：經(jīng)過試驗證明適合本地區(qū)栽培后，直接在生產(chǎn)上推廣種植。 3、引種馴化：外地種質(zhì)引入種植，由于生態(tài)條件改變而表現(xiàn)出新的性狀， 經(jīng)過選擇育成適合本地區(qū)推廣種植的新品種。 4、引種改良：外來品種的某個（些）優(yōu)良性狀用于改良本地品種。,第三節(jié) 引種與馴化,我國的600多種栽培植物中，有一半是國外引進(jìn)的；其中果樹和蔬菜作物大多是國外引進(jìn)的。,87,二、引種原理 （一）氣候相似性原理 原產(chǎn)地與引種地之間，影響作物生產(chǎn)的主要因素應(yīng)盡可能相似，以保證作物品種互相引用成功的可能性。 強調(diào)氣候中溫度條件；忽略光、濕、氣、土條件；忽略作物對環(huán)境適應(yīng)（馴化）。,88,（二）生態(tài)相似性原理 生態(tài)環(huán)境：作物品種形成和生長發(fā)育所處的環(huán)境（生態(tài)條件） 1）氣候生態(tài)因子：溫度、日照、雨量、濕度 2）土壤生態(tài)因子：土質(zhì)、水分、ph、鹽份、其他離子 3）生物生態(tài)因子：病蟲及其它們的小種和生物型、雜草,89,三、影響引種的因素 （一）外因 1、溫度：對作物生長和發(fā)育的影響 2、光照：對作物生長和發(fā)育的影響 3、緯度：同緯度光照、溫度相似 4、海拔：影響溫度、光強 5、栽培和土壤 （二）內(nèi)因 作物發(fā)育特性，根據(jù)作物生長對溫度和光照的要求將作物分成：低溫長日照作物、高溫短日照作物、中間性作物。,90,四、作物的引種規(guī)律 （一）低溫長日照作物（冬作物）： 高緯度地區(qū)品種，引種到低緯度地區(qū)種植，由于該地冬季溫度高和春季的日照短，不能滿足低溫和長日照，表現(xiàn)生育期延遲、營養(yǎng)器官加大、不能開花結(jié)實。 低緯度地區(qū)品種，引種到高緯度地區(qū)種植，由于該地區(qū)冬季溫度低和光照長，表現(xiàn)生育期縮短、植株矮小、產(chǎn)量低、春季可能凍害。,91,（二）高溫短日照作物（夏作物） 1、原產(chǎn)低緯度的品種： 春播品種（感溫） ：引到高緯度地區(qū)春播種植，由于溫度低，表現(xiàn)生育期延長、營養(yǎng)器官增大。但只要積溫滿足，可以獲得高產(chǎn)。而長光照對發(fā)育影響小。 夏播品種（感光）：引到高緯度地區(qū)種植，由于光照長， 不能滿足對短光照的要求，表現(xiàn)植株高大、遲熟、后期可能凍害。 2、原產(chǎn)于高緯度地區(qū)的品種（感溫） ： 引種到低緯度地區(qū)種植，由于高溫高，容易滿足溫度要求，表現(xiàn)生育期縮短、營養(yǎng)器官變小、產(chǎn)量低。 3、原產(chǎn)于高海拔地區(qū)的品種（感溫）：引到同緯度平原，早熟低產(chǎn)。,92,五、引種的工作環(huán)節(jié) 在實際工作中，引種原理或理論指導(dǎo)下，為了避免損失，保證成功，仍需按照一定的工作環(huán)節(jié)進(jìn)行： 1、明確引種的目標(biāo)和要求，收集材料，品種來源、生態(tài)類型 2、先試驗后引種，觀察試驗、 不同播期的多點試種，區(qū)域試驗或直接認(rèn)定 3、引種試驗和高產(chǎn)栽培試驗結(jié)合 4、植物檢疫：病、蟲、草等、隔離種植,93,六、植物馴化的原理 “風(fēng)土馴化學(xué)說”：生物體與其賴于生存的環(huán)境之間存在著對立統(tǒng)一的關(guān)系，生物體的遺傳可塑性使其能經(jīng)過馴化而適應(yīng)新環(huán)境。 選用遺傳不穩(wěn)定、易動搖的材料 1、根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育特性，植物可塑性差異 栽培種 野生種 次生生態(tài)型 原生生態(tài)型 新品種 老品種 異地品種 本地品種 雜交種 群體品種 純系,94,2、根據(jù)植物個體發(fā)育特性 早期 晚期 實生苗 無性繁殖材料 3、根據(jù)植物遺傳適應(yīng)性范圍 逐步遷移 如果樹、橡膠樹 4、植物馴化過程中應(yīng)結(jié)合適當(dāng)?shù)呐嘤椒?雜交、定向選擇、嫁接,95,一、現(xiàn)代育種的重要目標(biāo)性狀及策略,第四節(jié) 現(xiàn)代育種目標(biāo)與方法,（一）高產(chǎn)及育種策略 在育種策略上，為達(dá)到高產(chǎn)這一目的，似乎可將作物育種分為三個階段，即矮稈育種、理想株型育種和高光效育種。 1、矮稈育種 矮稈品種的增產(chǎn)作用是通過： 1）降低個體的植株高度、增加密度； 2）降低莖稈所占比重、提高收獲指數(shù)； 3）減少倒伏、提高穩(wěn)產(chǎn)性。 高產(chǎn)必須以生物學(xué)產(chǎn)量為基礎(chǔ)。,96,2、理想株型育種 集中形態(tài)特征和生理特性的優(yōu)良性狀，使其獲得最高的光能利用率，并能將光合產(chǎn)物最大限度地輸送到籽粒中去，通過提高收獲指數(shù)而提高籽粒產(chǎn)量。 在禾谷類作物上，如株型緊湊、葉片窄而短、挺直上沖，葉與莖的夾角小，葉色深 ，葉綠素含量高，比葉重（單位面積的葉片重量）大等。 理想株型應(yīng)不同生態(tài)條件而有差異。水稻上提出了三種理想株型：重穗型、叢生型和中間型。,97,超級稻株型設(shè)計示意 1. 產(chǎn)量1213t / hm2 2. 產(chǎn)量15t / hm2 3. 產(chǎn)量15t / hm2 以上,98,3、高光效育種 通過提高作物本身光合能力和降低呼吸消耗的生理指標(biāo)而提高作物產(chǎn)量的育種方法。 作物經(jīng)濟產(chǎn)量的高低與光合作用產(chǎn)物的生產(chǎn)、消耗、分配和積累有關(guān)。 高產(chǎn)品種應(yīng)該具有較高的光合能力（強度），較低的呼吸消耗，光合機能保持時間長，葉面積指數(shù)（lai）大，收獲指數(shù)高等特點。 轉(zhuǎn)c4植物高光效基因：c4植物：玉米、高粱、甘蔗，光合強度高，光呼吸低，選擇光合能力強的基因型；c3植物：小麥、水稻、大豆、棉花等，光合強度較低， 光呼吸高30%，篩選co2補償點低的高光效品種,99,（二）穩(wěn)產(chǎn)與育種策略 穩(wěn)產(chǎn)性是指優(yōu)良品種在推廣的不同地區(qū)和不同年份間產(chǎn)量變化幅度較小，在環(huán)境多變的條件下能夠保持均衡的增產(chǎn)作用。 1、抗病蟲性育種 單一寄主易引起流行病蟲害的發(fā)生，抗病育種越來越顯示出它的重要地位。 高產(chǎn)栽培肥水條件改善和矮稈品種帶來的高密度種植，都加重了病蟲害的發(fā)生。 抗病育種已從抗單一病害逐漸向抗多種病害發(fā)展，抗單一小種向抗多種小種發(fā)展。,100,2、 抗旱耐瘠育種 我國無灌溉條件的耕地半數(shù)以上，其中有些地區(qū)常年缺雨干旱，即使在雨量較多的地區(qū)大多雨量集中，季節(jié)性干旱也時有發(fā)生造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)。我國約有1/3以上耕地分布在丘陵山區(qū)，土層薄、肥力低，產(chǎn)量低而不穩(wěn)。 3、抗倒伏性育種 主要育種性狀，如株高、莖稈強度、根系等。 4、適應(yīng)性育種 指作物品種對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)范圍及程度。適應(yīng)性強的品種不僅種植地區(qū)廣泛、推廣面積大，更重要的是可在不同年份和地區(qū)間保持產(chǎn)量穩(wěn)定。,101,（三）優(yōu)質(zhì)及育種策略 作物品種的品質(zhì)已經(jīng)成為突出的育種目標(biāo)。國家在“九五”、“十五”已實施了優(yōu)質(zhì)米育種計劃，優(yōu)質(zhì)麥育種、優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種等。 品質(zhì)包括：營養(yǎng)品質(zhì)（蛋白、必須氨基酸含量）、加工品質(zhì)、商業(yè)品質(zhì)、衛(wèi)生品質(zhì)（農(nóng)藥殘留、重金屬含量、 有害微生物及其有毒產(chǎn)物）。,102,（四）適應(yīng)機械化及其策略 株形緊湊、成熟一致，管理方便、不倒伏、不落粒。 1）大豆結(jié)莢部位與地面有一定距離； 2）玉米穗位整齊適中； 3）馬鈴薯和甘薯的塊莖和塊根集中； 4）直播稻，可以減少作業(yè)強度，植株分蘗少，莖桿粗壯，抗倒伏。,103,20 世紀(jì)80 年代以來, 圍繞高產(chǎn)、多抗、優(yōu)質(zhì)綜合育種目標(biāo), 以及相應(yīng)采用誘變育種、花培育種、航天育種等手段, 常規(guī)稻和雜交稻選育取得了顯著進(jìn)展。,我國水稻育種的現(xiàn)狀,但在1994- 2003 年, 全國不同程度先后進(jìn)入調(diào)整糧食結(jié)構(gòu)、優(yōu)化品種結(jié)構(gòu)階段。90 年代以來,新的雜交水稻組合在熟期、米質(zhì)、抗性等方面雖有改進(jìn), 但在產(chǎn)量上未能獲得新的突破。因此, 進(jìn)一步提高水稻單位面積的產(chǎn)量, 已成為國內(nèi)外所關(guān)注的重要課題。,104,1997 年, 中國開始超級稻選育研究, 中國超級雜交稻研究也連續(xù)兩次獲得國家大額資助, 成為水稻育種界亮點。 2001 年, 中國科學(xué)家成功地完成公布了世界上第一個水稻全基因組芯片的研制及水稻全基因組表達(dá)譜繪制, 分離了與水稻抗逆、抗病、高產(chǎn)密切相關(guān)的40 個重要功能基因及400 多個 候選功能基因，隨后2003 年水稻育 種科技人員提出“基因設(shè)計育種將成 為第三次水稻育種突破口”這一新觀 點。,我國水稻育種的現(xiàn)狀,105,2009年最新審定優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻品種,龍粳21,墾稻17,龍粳24,龍粳25（龍花01-806）、龍粳26（龍育03-1804）龍粳27（龍交04-2182）、龍粳28（龍育04-1465）、墾稻19（墾04-1093）墾稻20（墾04-549）、墾稻21（墾04-951）,106,協(xié)優(yōu)107 選育單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所 品種來源：協(xié)青早aw107,特征特性：屬秈型三系雜交水稻。熟期適中，產(chǎn)量較高，穩(wěn)產(chǎn)性一般，中感白葉枯病，高感稻瘟病，米質(zhì)一般。適宜在福建、江西、湖南、湖北、安徽、浙江、江蘇的長江流域稻區(qū)（武陵山區(qū)除外）以及河南南部稻區(qū)的稻瘟病輕發(fā)區(qū)作一季中稻種植。,107,兩優(yōu)培九 選育單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 品種來源：培矮64s9311,特征特性：“兩優(yōu)培九”是我國第一個將兩系法與亞種間雜交合為一體的雜交稻，屬感溫型雜交中秈。標(biāo)志著我國雜交水稻育種研究進(jìn)入了一個超高產(chǎn)時代。千粒重2627克，分蘗力強，莖稈粗壯，中后期株型緊湊，抗倒性強。劍葉上舉高出穗層，群體受光姿態(tài)良好。穗型大，谷粒細(xì)長、無芒，米質(zhì)較好，適應(yīng)性廣，易感稻曲病。,108,豐優(yōu)香占 選育單位：江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 品種來源：粵豐a r6547,特征特性：為遲熟中秈類型。苗期葉挺、色深，繁茂性好，分蘗性中等。株型挺拔，集散適中。莖稈粗壯，葉片挺拔上舉，穗大粒重，生長清秀，熟相頗佳。高抗白葉枯病,且抗稻瘟病和生育后期的葉部病害，抗倒性較強。米飯松散柔軟，香味濃郁，冷后不硬，適口性極佳。 豐優(yōu)香占的米質(zhì)能與 泰國名牌大米相媲美， 而產(chǎn)量超過泰國米一倍。,109,國內(nèi)優(yōu)質(zhì)小麥品種,偃育898 豫審平安3號 偃展4110 豫麥18 豫麥18-99系 焦麥668 鄭麥9023,110,1、細(xì)胞工程在植物育種中應(yīng)用 2、基因工程育種 3、分子標(biāo)記輔助選擇育種 4、分子設(shè)計育種,二、現(xiàn)代作物育種新方法概述,111,細(xì)胞工程在植物育種中應(yīng)用,112,一、組織培養(yǎng)基本程序: 材料準(zhǔn)備、培養(yǎng)基準(zhǔn)備、接種、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的分化、小苗移栽、植株,植物組織培養(yǎng)流程圖 a:外植體來源, b：外植體培養(yǎng), c：愈傷組織, d：再生小植株, e：再生植株,113,外植體,愈傷組織,新植株,114,（一）培養(yǎng)基及其組成,1、常用的培養(yǎng)基: 1）ms培養(yǎng)基：無機鹽和離子濃度較高，養(yǎng)分平衡，最普通。 2）b5培養(yǎng)基：含有較低的銨離子。 3）white培養(yǎng)基：無機鹽含量較低，適于生根培養(yǎng)。 4）km-8p培養(yǎng)基：用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，有機成分較復(fù)雜。 5）n6培養(yǎng)基：用于花藥培養(yǎng)，成分較簡單，kno3和硫銨高。,115,2、 培養(yǎng)基的成分 1）無機鹽類：為外植體的細(xì)胞分裂、生長和分化提供必須的大量元素和微量元素。 大量：n、p、k、s、ca、mg； 微量：i、b、mn、zn、mo、cu、co、fe 2）碳源和能源：所有培養(yǎng)基都需要糖作為碳源和能源，維持滲透壓。常用2%-5%的蔗糖，也有用葡萄糖和果糖。 3）維生素：維生素類物質(zhì)直接參與酶的合成以及蛋白質(zhì)、脂肪代謝等生命活動。如vb1,vb6,vb3,葉酸，抗壞血酸(vc)等 4）氨基酸和有機附加物：氨基酸是蛋白質(zhì)組成成分也是有機氮源；另外還常添加一些有機物，如揶子汁、酵母提取液等，對某些組織或器官的培養(yǎng)具有促進(jìn)作用。,116,5）植物激素：是培養(yǎng)基中不可缺少的成分，對愈傷組織的誘導(dǎo)和器官分化有直接影響。 生長素：促進(jìn)細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織、促進(jìn)根的分化。常用的有2,4-d(2，4-二氯苯氧乙酸），吲哚乙酸iaa,吲哚丁酸iba等。其中2，4-d對有誘導(dǎo)愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的效果最好，但對根和芽的分化有抑制作用； 細(xì)胞分裂素：促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官分化、誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成、延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成。常用的細(xì)胞分裂素有激動素kt，玉米素zt，6-ba(6-芐基腺嘌呤）等。 赤霉素ga3：ga3具有促進(jìn)細(xì)胞生長和啟動細(xì)胞分裂作用，還可以促進(jìn)器官和胚狀體的生長。 aba： aba對個別培養(yǎng)物芽的形成有作用。,117,（二）無菌操作方法 1、在接種前, 確保培養(yǎng)材料完全無菌。 2、培養(yǎng)基配制、接種等整個操作過程必須始終保持無菌狀態(tài)。 3、無菌培養(yǎng)，接種后移入培養(yǎng)室培養(yǎng)，要求培養(yǎng)室衛(wèi)生，恒溫，有理想的光照控制系統(tǒng)，一般材料要求25左右。,118,二、體細(xì)胞克隆變異及其育種利用,（一）概述 體細(xì)胞克隆變異（somaclonal variation）是指植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異。,119,（二）突變類型 1、抗性突變體，抗病、耐鹽、抗重金屬等，實驗室內(nèi)篩選 2、形態(tài)性狀突變體，如矮化性、葉型等。 3、不育性突變體，大多為核基因的突變，可以用來培育不育系。 4、產(chǎn)量和品質(zhì)的突變，田間篩選確定。,120,1、處理材料：外植體、愈傷組織、懸浮系、花粉 2、為了增加突變頻率，需要進(jìn)行誘變處理。 3、篩選對象:原生質(zhì)體、愈傷塊、懸浮培養(yǎng)物和花粉/小孢子培養(yǎng)物。,（三）突變體的篩選,121,（四）在作物改良上的應(yīng)用,圖15-4. 利用體細(xì)胞克隆變異育種的技術(shù)路線,誘變劑 篩選劑,122,三、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種利用,(一) 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用價值,花粉培養(yǎng)和花藥培養(yǎng):將花藥(或花粉粒)進(jìn)行人工培養(yǎng)發(fā)育生成植株。,123,優(yōu)點： 1、后代的快速純合 通過人工加倍(秋水仙素)用單倍體產(chǎn)生加倍單倍體（dh群體），縮短育種周期。 2、提高選擇效率 如果某一性狀受一對基因控制，f2純合aa個體只有1/4。如f1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中aa個體占1/2。,124,3、排除雜種優(yōu)勢干擾 采用dh群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實變異。 4、突變體的篩選 單倍體的各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，提高了抗性或其它突變體篩選效率。,125,省去了多代的自交純合.,126,四、幼胚培養(yǎng)與遠(yuǎn)緣雜交育種,植物胚胎培養(yǎng)(embryo culture)：是指使胚及胚器官（如子房、胚珠）在離體條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。 植物幼胚和胚珠培養(yǎng)是植物遠(yuǎn)緣雜交育種的重要輔助手段?？朔夒s交雜種夭亡。,127,1、優(yōu)點：空間少、可避免病蟲害的侵襲，特定的條件下可以長期保存，需要時只需將材料取出來迅速繁殖。 2、方法：超低溫保存法可以長期保存植物材料，不需要繼代。液氮（-1920c），超低溫冰箱（-80-1500c，干冰（-790c）。 3、保存的材料：可多種類型，可以是各種組織、細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織、莖尖、幼胚等。,五、細(xì)胞與組織培養(yǎng)離體試管保存（種質(zhì)的長期保存）,128,無性繁殖作物，由于病毒或其它病原菌的侵染，常常導(dǎo)致種性退化，產(chǎn)量低、品質(zhì)下降。 病原菌在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，在受侵染的植株中，頂端分生組織由于細(xì)胞分別快，一般不帶毒或濃度很低的病毒。可利用莖尖連續(xù)的培養(yǎng)的方法使植物脫去病毒。,六、脫毒,129,人工種子(artificial seeds)是指將細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或其類似物，經(jīng)過有機化合物的包埋而形成的能在適宜條件下發(fā)芽的類似于天然植物種子的顆粒體。 通常由三部分組成：體細(xì)胞胚、人工胚乳、人工種皮。固定雜種優(yōu)勢、快速繁殖良種和不育材料、節(jié)約用種、工廠化生產(chǎn)種子方面都有潛在價值。,八、人工種子的生產(chǎn),七、繁殖重要品種或材料,保持f1雜種優(yōu)勢，稀有資源繁殖。大多數(shù)果樹和觀賞植物是高度雜合的，它們的種子后代無法與原品種相同，需利用莖尖培養(yǎng)快速繁殖。,130,九、組織培養(yǎng)與多倍體育種,秋水仙素誘導(dǎo)百合鱗片得到巨大鱗芽,十、組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因育種,131,（一）原生質(zhì)體的分離方法 植物原生質(zhì)體(protoplast)是一個沒有細(xì)胞壁的細(xì)胞。 機械法分離：早期采用的分離方法，先對材料進(jìn)行質(zhì)壁分離處理，然后切割，可以獲得少量的不受損傷的原生質(zhì)體。 酶法分離：常用的方法 一步法是將果膠酶(pectinase)和纖維素酶(celluluse)等混合處理材料，直接分離獲得原生質(zhì)體； 二步法是先用果膠酶處理材料，降解細(xì)胞間層使細(xì)胞分離，再用纖維素酶水解胞壁釋放原生質(zhì)體。目前多用一步法。,十一、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交,132,1、固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)，將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或原生質(zhì)體按一定的密度接種到一薄層固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。 2、飼養(yǎng)培養(yǎng)：將原生質(zhì)體與一些被x射線照射而失去分裂能力的原生質(zhì)體混合后包埋在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 3、液體培養(yǎng)：將含有一定密度的細(xì)胞或原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)皿或瓶子中靜止培養(yǎng)的方法。 4、看護(hù)培養(yǎng)：用一個愈傷組織來看護(hù)單細(xì)胞原生質(zhì)體，為其提供營養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞生長與增殖。,（二）原生質(zhì)體的培養(yǎng),133,134,1、概述 原生質(zhì)體融合（體細(xì)胞雜交）是指不同遺傳背景的原生質(zhì)體之間經(jīng)過融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞的細(xì)胞工程技術(shù)。 原生質(zhì)體融合(protoplast fusion)技術(shù)可以打破生殖隔離，是實現(xiàn)基因重組的一條途徑。 目前利用細(xì)胞融合已從很多作物種、屬間，甚至科間獲得體細(xì)胞雜種，創(chuàng)造了一些自然界不存在的植物類型，有效地拓寬了植物育種的資源。,（三）細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交）,135,136,1）nano3處理誘發(fā)融合 2）高ph高濃度鈣離子處理 3）peg（聚乙二醇）處理 4）電融合,2、常用的融合方法,137,植物體細(xì)胞雜交,去掉細(xì)胞壁,原生質(zhì)體a,原生質(zhì)體b,愈傷組織,雜種植株,細(xì)胞分裂,雜種細(xì)胞,融合,細(xì)胞壁再生,138,1）形態(tài)互補 利用兩種原生質(zhì)體形態(tài)色澤上的差異，在融合后，在顯微鏡下可以找出異源融合體。 2）遺傳互補 單個隱性突變性狀（如：白化）可以與某一形態(tài)性狀結(jié)合起來用于篩選。,3、雜種細(xì)胞的篩選,139,3）代謝互補 利用兩種營養(yǎng)缺陷型或兩種抗性突變體的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，在同時缺陷兩種物質(zhì)或同時含有兩種有害物質(zhì)的培養(yǎng)基上篩選雜種細(xì)胞，能生長的細(xì)胞團可以初步認(rèn)為由雜種細(xì)胞形成。 4）生長互補 雙親原生質(zhì)體的生長需要外源生長激素，而由雙親原生質(zhì)體融合后形成對生長激素自主的雜種細(xì)胞，能在無外源生長激素的培養(yǎng)基上生長。,140,1）形態(tài)學(xué)鑒定：最簡單的方法，葉形通常介于雙親之間，葉面積居中，花器官（花冠長度、顏色、形態(tài)等）帶有雙親性狀。 2）細(xì)胞學(xué)鑒定:染色體計數(shù)、帶型為混合體，但不一定是雙親之和 3）同工酶分析：融合后形成的雜種應(yīng)該表現(xiàn)出雙親的同工酶帶型 4）分子標(biāo)記鑒定：細(xì)胞核基因組和線粒體、葉綠體dna分子雜交進(jìn)行核-核雜種、核-質(zhì)雜種或質(zhì)質(zhì)雜種進(jìn)行更精細(xì)的鑒定。,4、雜種的鑒定,141,植物基因工程育種,142,traditional crossbreeding,recombinant dna techniques,一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種概述,143,（一）與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種的優(yōu)勢： 1、轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)體系的建立使可利用的基因資源大拓寬； 2、轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗，適應(yīng)各種不良環(huán)境條件的優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑； 3、利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可以對植物的目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇，可以對多個基因進(jìn)行定向操作； 4、利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以大大提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。 5、通過轉(zhuǎn)基因的方法，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。,144,（二）全球轉(zhuǎn)基因作物栽培面積,145,美國：3900萬公頃 加拿大：350萬公頃 阿根廷：1350萬公頃 中國：210萬公頃,146,（三）轉(zhuǎn)基因主要作物,147,二、 轉(zhuǎn)基因育種的程序,基因分離,體外重組,轉(zhuǎn)化,篩選,安全性評價,結(jié)合常規(guī)育種,轉(zhuǎn)基因品種,安全性評價,市場開發(fā),148,(一)目的基因的獲得,1、根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白進(jìn)行基因克隆 根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行基因克隆的主要步驟如下：,分離蛋白質(zhì),明確氨基酸序列,推導(dǎo)核苷酸序列,人工合成,149,2、從基因組dna或mrna序列克隆基因,(1)同源序列法 (homology based candidate gene method) 根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有保守氨基酸序列的特點發(fā)展的一條快捷克隆基因家族未知成員的新途徑，即基于同源序列的候選基因法。,氨基酸序列比較,設(shè)計簡并引物,pcr擴增,文庫篩選/race,150,(2)表達(dá)序列標(biāo)簽est 能夠特異性標(biāo)記某個基因的部分序列，通常包含了該基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。目前，表達(dá)序列標(biāo)簽主要是通過cdna的途徑獲得。,mrna,cdna,反轉(zhuǎn)錄酶,cdna文庫,pcr,差異顯示,抑制消減雜交,est,race/文庫篩選,dbest,genbank,151,(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因 植物的大多數(shù)性狀在植物生長發(fā)育過程中的功能還不清楚，有的基因表達(dá)產(chǎn)物量很低，限制了根據(jù)基因功能進(jìn)行基因克隆。隨著各種生物分子標(biāo)記連鎖圖的相繼建立和越來越多的基因被定位，圖位克隆技術(shù)(map-based cloning)也應(yīng)運而生。,152,marker,cm,1,0.8,a,gene,c,bp,bac,染色體步移,亞克隆,cdna文庫篩選,互補實驗,精細(xì)定位,染色體步移,候選基因,153,(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法 轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復(fù)制、移動的 dna片段，復(fù)制的拷貝可以從染色體的一個位置跳到另一個位置。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個功能基因內(nèi)部時，就會引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點時，失活基因的功能又可得到恢復(fù)。 通過遺傳分析可以確定某種基因的突變是否是由于轉(zhuǎn)座子的插入而引起的?？梢詫⑥D(zhuǎn)座子 dna制成探針，對突變株的基因組文庫進(jìn)行雜交，并釣出含有該轉(zhuǎn)座子的 dna片段，獲得含有部分突變株dna序列的克隆，進(jìn)而將所獲得的突變株的部分dna序列制成探針，篩選野生型的基因組文庫，最終得到完整的基因。目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是ac/ds玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。,插入突變體,篩選文庫或pcr,鑒定性狀,互補實驗,154,pcr的方法,155,(5)差異顯示法 通過對來源特定組織類型的總mrna進(jìn)行pcr擴增、電泳，并找出待測組織和對照之間的特異擴增條帶，該條帶就有可能是全長或者是部分特異表達(dá)的基因，利用這種方法進(jìn)行基因克隆的方式就稱為差異顯示法基因克隆。,葉mrna,根mrna,反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄,pcr,隨機引物+3 錨定poly(t)引物,pcr,page,葉,根,156,(6) cdna微陣列, cdna 芯片 將cdna序列通過機器點樣于固定支持物,與熒光標(biāo)記的不同mrna樣品分別進(jìn)行雜交,通過激光共聚焦掃描分析不同cdna序列的雜交信號強度,判斷該cdna在不同mrna樣品中的表達(dá)豐度.,mrna 1,mrna 2,157,(7) 電子克隆 in silico cloning 借助于電子計算機，利用公布的核酸序列資料，進(jìn)行序列的拼接和組裝最終獲得完整基因序列的技術(shù)，類似于cdna文庫的篩選但更加方便和快速。,158,（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過上述方法克隆得到目的基因只是為利用外源基因提供了基礎(chǔ)，要將外源基因轉(zhuǎn)移到受體植株還必須對目的基因進(jìn)行體外重組。,農(nóng)桿菌介導(dǎo) 2) 基因槍,159,分離基因,克隆到某中間載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取質(zhì)粒,限制酶切/連接,克隆到植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,電轉(zhuǎn)化,pks,pbr332,pgem-t,jm109, top10,hindiii/ecroi t4 ligase,pbi121, pcam1001,lba4404, eha,160,(三）受體材料的選擇,1、愈傷組織再生系統(tǒng) 指外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，再通過分化培養(yǎng)獲得再生植株的再生系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有外植體材料來源廣泛，繁殖迅速，易于接受外源基因，并且轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點。,2、直接分化再生系統(tǒng) 外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株，該系統(tǒng)周期短、操作簡單，遺傳穩(wěn)定，有些植物莖尖分生培養(yǎng)困難，遺傳轉(zhuǎn)化率低。,161,3、原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 原生質(zhì)體在適當(dāng)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出再生植株，可以作為受體材料，該系統(tǒng)能直接高效、廣泛地攝取外源dna或遺傳物質(zhì)，可以獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，并適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點是不易制備、再生困難和變異程度高等。,4、胚狀體再生系統(tǒng) 胚狀體作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體具有個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因的能力強，轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生等優(yōu)點。不足之處是所需技術(shù)含量較高，許多植物不易獲得胚狀體。,162,5、生殖細(xì)胞受體系統(tǒng) 目前主要從兩個途徑利用生殖細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化：一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。,163,（四）轉(zhuǎn)基因方法的確定和和外源基因的轉(zhuǎn)化 第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法；第二類是外源目的dna的直接轉(zhuǎn)化。,1、載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 載體法是目前為止最常見的一類轉(zhuǎn)基因方法。其基本原理是將外源基因重組進(jìn)入適合的載體系統(tǒng)，通過載體攜帶將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞并整合在核染色體組中，并隨著核染色體一起復(fù)制和表達(dá)。 農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒（tumor-inducing plasmid）或 ri質(zhì)粒(root-indcing plasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。,164,農(nóng)桿菌共培養(yǎng),ms培養(yǎng)基培養(yǎng),生芽,生根,葉盤轉(zhuǎn)化法,(1)葉盤法 雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。,165,(2)真空滲入法 將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。 這是一種簡便、快速、可靠而且不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的基因轉(zhuǎn)移方法，具有良好的研究與應(yīng)用前景。,166,2、外源基因直接導(dǎo)入法 直接利用理化因素進(jìn)行外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法 ，主要包括化學(xué)刺激法、基因槍轟擊法等。,(1)基因槍轟擊法 基因槍轟擊法也稱為微彈轟擊技術(shù)(micro-projectile bombardment)和粒子槍法，其基本原理是將外源dna包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，然后借助高壓動力射入受體細(xì)胞或組織，當(dāng)微粒上的dna進(jìn)入細(xì)胞后將整合到植物基因組中并得以表達(dá)。 步驟簡單易行，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為研究植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物的最有效方法之一。基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。,167,(2)微注射法 利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細(xì)胞固定，然后將供體dna或rna直接注射進(jìn)入受體細(xì)胞。 所用受體一般是原生質(zhì)體或生殖細(xì)胞，對于具有較大子房或胚囊的植株則無須進(jìn)行細(xì)胞固定，在田間就可以進(jìn)行活體操作，被稱為“子房注射法”或“花粉管通道法”。以煙草、苜蓿和玉米原生質(zhì)體等為受體材料，利用上述方法都獲得了成功。此外，在玉米、小麥、水稻等多種植物上，也有利用子房注射法成功地獲得轉(zhuǎn)基因植株的報道。 微注射法的優(yōu)點是可以進(jìn)行活體操作，不影響植物體正常的發(fā)育進(jìn)程。田間子房注射操作簡便、成本低。,168,1、轉(zhuǎn)化體的篩選 為了有效地選擇出這些真正的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使用特異性的選擇標(biāo)記基因（selectable marker genes）進(jìn)行標(biāo)記。 常用選擇標(biāo)記基因包括抗生素抗性基因及除草劑抗性基因兩大類，如卡那霉素抗性基因npt和潮霉素抗性基因hpt，除草劑抗性基因bar基因和glyphosate抗性基因epsps等。 在實際工作中，是將選擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動子構(gòu)成嵌合基因并克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時進(jìn)行轉(zhuǎn)化。當(dāng)標(biāo)記基因被導(dǎo)入受體細(xì)胞之后，就會使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力，抑制、殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞則能夠存活下來。,（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定,169,2、轉(zhuǎn)化體的鑒定 通過篩選得到的再生植株只能初步證明標(biāo)記基因已經(jīng)整合進(jìn)入受體細(xì)胞，至于目的基因是否整合、表達(dá)還一無所知，因此還必須對抗性植株進(jìn)一步檢測。,170,(1) dna水平的鑒定 檢測外源目的基因是否整合進(jìn)入受體基因組，整合的拷貝數(shù)以及整合的位置，常用的檢測方法主要有特異性pcr檢測和southern雜交。 1）特異性pcr反應(yīng) 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 技術(shù)，以待檢測植株的總dna為模板在體外進(jìn)行擴增，檢測擴增產(chǎn)物片段的大小以驗證是否和目的基因片段的大小相符，從而判斷外源基因是否整合到轉(zhuǎn)化植株之中。 特異性pcr檢測方法具有簡單、迅速費用少的優(yōu)點，但是檢測結(jié)果有時不可靠，假陽性率高，因此必須與其它方法配合使用。,171,2）southern雜交 原理：依外源目的基因堿基同源性配對進(jìn)行的，雜交后能產(chǎn)生雜交印跡或雜交帶的轉(zhuǎn)化植株為轉(zhuǎn)基因植株，未產(chǎn)生雜交印跡或雜交帶的為非轉(zhuǎn)基因植株。 一般是將外源目的基因全部或部分序列制成探針與轉(zhuǎn)化植株的總dna進(jìn)行雜交，它是從dna水平上對轉(zhuǎn)化體是否整合外源基因以及整合的拷貝數(shù)進(jìn)行鑒定的方法，southern雜交是目前檢測轉(zhuǎn)基因植株最主要的方法之一。,172,(2) 轉(zhuǎn)錄水平的鑒定 通過southern雜交可以得知外源基因是否整合到染色體上。但是，整合到染色體上的外源基因能否表達(dá)還未知，因此必須對外源基因的表達(dá)情況進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平鑒定。 轉(zhuǎn)錄水平鑒定是對外源基因轉(zhuǎn)錄形成mrna情況進(jìn)行檢測，常用的方法主要有northern雜交和rt-pcr 檢測。,173,1）northern雜交 又分為northern 斑點雜交和印跡雜交。其中斑點雜交原理是利用標(biāo)記的rna探針對來源于轉(zhuǎn)化植株的總rna進(jìn)行雜交，通過檢測雜交條帶放射性、或其它標(biāo)記信號的有無和強弱來判斷目的基因轉(zhuǎn)錄與否以及轉(zhuǎn)錄水平。 northern印跡雜交的基本原理是先提取植物的總rna或者mrna用變性凝膠電泳分離，將它們原位轉(zhuǎn)移到固相膜上，在適宜的離子強度及溫度下，探針與膜上同源序列雜交，形成rna-dna雜交雙鏈。通過探針的標(biāo)記性質(zhì)可以檢測出雜交體，并根據(jù)雜交體在膜上的位置可以分析出雜交rna的大小。,174,2）rt-pcr 原理是以植物總rna或者mrna為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后再經(jīng)pcr擴增，若擴增條帶與目的基因的大小相符，則說明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄。 如同檢測外源基因是否整合進(jìn)入基因組dna時所用的特異性pcr方法一樣，用rt-pcr法檢測外源基因轉(zhuǎn)錄情況具有簡單、迅速的優(yōu)點，但是對外源基因轉(zhuǎn)錄的最后確定，還需要與northern 雜交的實驗結(jié)果相互結(jié)合驗證。,175,（3）翻譯水平的鑒定 為檢測外源基因轉(zhuǎn)錄形成的mrna能否翻譯，還必須進(jìn)行翻譯或者蛋白質(zhì)水平檢測，最主要的方法是western雜交。 western雜交中，先將從轉(zhuǎn)基因植株提取的待測樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)過sds聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到固相支持物上（常用硝酸纖維素濾膜）；然后與抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體反應(yīng)；最后，結(jié)合上的抗體可用多種二級免疫學(xué)試劑進(jìn)行檢測。,176,（六）轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用 通過上述鑒定證實攜帶目的基因的轉(zhuǎn)化體，還必須根據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進(jìn)行安全性評價和大田育種利用研究。 利用轉(zhuǎn)基因方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株，常常存在外源基因失活、純合致死、花粉致死效應(yīng)，以及目標(biāo)性狀明確的基因?qū)胫参锖笥捎诓迦胛稽c的原因可能導(dǎo)致其它性狀的變化等現(xiàn)象；有些轉(zhuǎn)基因植株可能會由于組織培養(yǎng)方面的原因造成結(jié)實率降低。 通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種（系），一般在獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合利用雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。,177,討論：轉(zhuǎn)基因食物安全么？,178,179,180,分子標(biāo)記輔助選擇