制藥復習題.doc

1、 生物技術(shù)包含哪些方面的內(nèi)容？答：基因工程（核心和關(guān)鍵，主導技術(shù)）、細胞工程（基礎(chǔ)）、酶工程（條件）、發(fā)酵工程（獲得產(chǎn)品的手段）及生化工程2、 生物技術(shù)藥物有哪些特點？答：分子結(jié)構(gòu)復雜具有種屬特異性治療針對性強、療效高穩(wěn)定性差基因穩(wěn)定性免疫原性體內(nèi)的半衰期短受體效應多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應檢驗的特殊性3、 基因工程技術(shù)的概念及基因工程藥物生產(chǎn)的過程？答：基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復制和表達的技術(shù)。一般程序：獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌（或細菌）培養(yǎng)工程菌除菌過濾半成品檢定包裝4、 目的基因獲得的方法有哪些？答：一、逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成cDNA克隆將重組體導入宿主細胞cDNA文庫的鑒定目的cDNA克隆的分離和鑒定二、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法：該方法是mRNA經(jīng)反應轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，不需要再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協(xié)助下，用PCR法進行擴增，特異性地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。三、化學法：較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學合成法獲得。合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。5、反轉(zhuǎn)錄法、反轉(zhuǎn)錄PCR、反轉(zhuǎn)錄法操作流程 答：反轉(zhuǎn)錄法：為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可以從生產(chǎn)該蛋白的真核細胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA互補DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法：該方法是mRNA經(jīng)反應轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，不需要再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協(xié)助下，用PCR法進行擴增，特異性地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成cDNA克隆將重組體導入宿主細胞cDNA文庫的鑒定目的cDNA克隆的分離和鑒定6、宿主菌選擇的依據(jù)，常用的宿主菌有哪些？答： 容易獲得較高濃度的細胞； 能利用易得廉價原料 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素 發(fā)熱量低，需氧低，適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài) 容易進行代謝調(diào)控 容易進行DNA技術(shù)操作 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，且易提取純化。菌種：原核細胞：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，鏈霉菌；真核細胞：酵母、絲狀真菌7、基因工程菌的不穩(wěn)定性表現(xiàn)在哪些地方？提高的方法有哪些？答：基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式： 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失。 分裂不穩(wěn)定性：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸提高方法：1、選擇合適的宿主菌；2、選擇合適的載體；3、選擇壓力；4、分階段控制培養(yǎng)；5、控制培養(yǎng)條件；6、固定化8、基因工程藥物的分離純化的基本過程，細胞破碎的方法有哪些？ 答：細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純化以及成品加工細胞破碎方法：物理破碎法：（1）高壓勻漿法（2）高速珠磨法（3）超聲波破碎法（4）高壓擠壓法；化學破碎法：（1）滲透沖擊（2）增容法（3）脂容法；生物破碎法：生物酶消化溶解細胞壁和細胞膜的方法。9、蛋白質(zhì)分離純化的基本方法及其基本原理 答：分離原理分離方法分子大小凝膠過程電荷離子交換等電點色譜聚焦疏水特性疏水作用反相生物親和性親和10、產(chǎn)品的保存方法答：1、液態(tài)保存：（1）低溫保存（2）在穩(wěn)定PH條件下保存（3）高濃度保存（4）加保護劑保存2、固態(tài)保存：制成干粉或結(jié)晶，冷凍干燥11、離體培養(yǎng)的細胞分類答：貼壁依賴型（貼壁細胞）和貼壁非依賴型（懸浮細胞）12、接觸抑制、細胞工程答：接觸抑制：當細胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸會合成片時，即每個細胞與其周期的細胞相互接觸時。細胞就停止繁殖。此時若能保持充足的營養(yǎng)，細胞仍可存活相當一段時間。但細胞密度密度不再增加，所以該現(xiàn)象稱之為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。細胞工程：以細胞為單位，按人們的意志，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術(shù)，有目的地進行精心設(shè)計，精心操作，使細胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達到改良或生產(chǎn)新品種的目的，以及使細胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定功能產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進行大量培養(yǎng)、增值，并提取出對人類有用的產(chǎn)品。13、生產(chǎn)用動物細胞有哪幾類，基本概念答：1、原代細胞：原代細胞是直接取自動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細胞懸液。2、二倍體細胞系：原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從而從多種細胞成分的組織中挑選并純化某種具有一定特性的細胞株。3、轉(zhuǎn)化細胞系：這類細胞是通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，他常常由于染色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了正常細胞的特點，而獲得了無限增值的能力。4、融合細胞系：兩個或兩個以上的細胞合并成一個細胞的過程。5、重組工程細胞系14、基因載體導入動物細胞的方法？答：融合法化學法物理法病毒法細胞融合法DNA-磷酸鈣電穿孔法重組逆轉(zhuǎn)病毒介導法脂質(zhì)體融合法DEAE-葡聚糖法顯微注射法重組DNA病毒介導法微生物介導法染色體介導法基礎(chǔ)槍法多瘤病毒樣顆粒介導法原生質(zhì)融合法鬼影紅細胞介導法15、動物細胞培養(yǎng)基的分類，無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點答：1、天然培養(yǎng)基；2、合成培養(yǎng)基；3、無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基優(yōu)點：提高細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批次之間差異的影響減少了由血清帶來病毒、真菌和支原體等微生物的危險供應充足、穩(wěn)定。細胞產(chǎn)品易于純化避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于對實驗結(jié)果的分析。16、動物細胞產(chǎn)品分離純化高成本的原因是什么？答：工程細胞表達的產(chǎn)物，通常和細胞內(nèi)容物、培養(yǎng)及成分，特別是當采用有血清培養(yǎng)基時小牛血清中的各種蛋白成分等都將與產(chǎn)物混雜在一起，而這些成分的物化性質(zhì)又常常和目的產(chǎn)物非常相似，因此很難將它們分離開由于產(chǎn)品多數(shù)用于人體，為防止雜質(zhì)對人體的有害作用，因此對產(chǎn)品的純度要求很高大多數(shù)動物細胞表達的產(chǎn)物產(chǎn)量低、生物活性很不穩(wěn)定，因此要求純化過程中所有的操作都應該非常溫和、精細，包括溶液的溫度、PH和鹽離子強度等都需要嚴格控制，這就需要有相當精密的設(shè)備和檢測儀器由于細胞產(chǎn)品多種多樣，它們的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量大小和等電點等都不盡相同，因此分離純化技術(shù)的通用性差，必須根據(jù)每一種產(chǎn)品的特點研究開發(fā)出適合于該產(chǎn)品的專用的分離純化技術(shù)。17、單克隆抗體的概念及其基本制備流程答：單克隆抗體：由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點。制備流程：淋巴細胞（致敏動物的脾細胞）+骨髓瘤細胞（腹水癌型漿細胞） 把融合細胞選擇出來使成單個細胞，培養(yǎng)雜交瘤細胞 使能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞克隆化把已克隆化的雜交瘤 把已克隆化的雜交瘤細胞細胞進行大量培養(yǎng) 注入純系小鼠腹腔內(nèi) 培養(yǎng)液中含單克隆抗體 小鼠腹水中含單克隆抗體18、單克隆抗體存在的兩大問題是什么？答：單克隆抗體均是鼠源性抗體，應用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人鼠抗體，加速了排斥反應，在人體內(nèi)半衰期只有56h，難以維持有效藥物作用靶組織時間。完整的抗體分子，即Ig的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。改造：降低單克隆抗體的免疫原性。降低單克隆抗體的相對分子質(zhì)量。19、單克隆抗體及其結(jié)構(gòu)答：一、 人-鼠嵌合抗體將鼠單克隆抗體（MAb）的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合二、 改形抗體在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進一步將鼠單克隆抗體（MAb）可變區(qū)中相對保守的FR替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合的CDR部位（即CDR移植）三、 Fab和Fv抗體Fab抗體：Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體相對分子量只有完整lgG的1/3。Fv抗體：由VH和VL組成的具有完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段，表現(xiàn)出與完整抗體相似的結(jié)合活性，它的發(fā)現(xiàn)推動了抗體的體外重組技術(shù)的發(fā)展。四、 單鏈抗體單鏈抗體（scFv）是由VH和VL 通過連接肽（接頭）重組并表達而成的另外一種小分子抗體，是具有親代抗體全部抗原結(jié)合特意性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。五、單域抗體和分子識別單位抗體與抗原的結(jié)合主要是由lg的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL 一個功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個lg分子的1/12，故稱之為小抗體。抗體抗原的結(jié)合是經(jīng)過互補決定區(qū)（CDR）而實現(xiàn)的。因此，CDR是構(gòu)成抗原抗體的最小結(jié)構(gòu)單位，根據(jù)這一特點，可以設(shè)計出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個CDR多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽（HRP），亦稱為最小識別單位。20、雙功能抗體、多功能抗體答：雙功能抗體就是雙特異性單鏈抗體。將兩條不同來源的scFv組合成具有兩種不同抗原結(jié)合特征的新型抗體即為雙特異單鏈抗體。多功能抗體：在scFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的scFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。其中包括雙鏈抗體，三鏈抗體，微型抗體及四鏈抗體等。21、植物細胞的全能型、分化、再分化、次級代謝及次級代謝產(chǎn)物答：全能型：植物體中任何一個具有完整細胞核（完整染色體組）的細胞，在一定條件下都可以重新再分化形成原來的個體。分化：可以分為胚胎發(fā)生和器官發(fā)生兩個階段。前者從精子與卵細胞結(jié)合開始，分化為幼胚，進而發(fā)育為成熟胚和種子。種子在適宜條件下萌發(fā)，通過器官分化過程，形成根、莖、葉、花和果實。再分化：通過脫分化誘導形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化成為胚狀體或直接分化出器官。次級代謝：是由特異性蛋白質(zhì)調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合過程。次級代謝產(chǎn)物：具有如下特征的成分稱為次級代謝產(chǎn)物（1）有明顯的分類學區(qū)域界限（2）其合成需要在一定條件下才能進行（3）缺乏明顯的生理功能（4）是生命過程的多余成份。22、植物細胞的結(jié)構(gòu)特征答：基本特征是含有剛性的細胞壁和大的液泡。23、影響植物細胞次級代謝產(chǎn)物的積累的因素？答：影響因素：（1）生物條件-外植體、取材季節(jié)、休眠、分化。（2）物理條件-溫度、光照、氧氣、PH值、滲透壓。（3）化學條件-無機鹽（N、P、K），碳源、植物生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前體。（4）工業(yè)培養(yǎng)條件-培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌、培養(yǎng)方法。24、誘導子：PPT：觸發(fā)植物細胞開始合成次級代謝產(chǎn)物的信號物質(zhì)就是誘導子（書上：是植物抗病生理過程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物過敏反應）分類：（1）內(nèi)源性誘導子（2）外源性誘導子：多糖類，糖蛋白類，蛋白質(zhì)類和不飽和脂肪酸類。25、酶工程研究的主要內(nèi)容？酶工程：從應用的目的出發(fā)研究酶、應用酶的特異性催化功能并通過工程將相應原料轉(zhuǎn)化為有用物質(zhì)。答：a. 酶的分離純化、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應用開發(fā)；b. 酶和細胞的固定化及酶反應器的研究，包括酶傳感器、反應監(jiān)測；c. 酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應用及遺傳修飾酶的研究；d. 酶的分子改造和化學修飾，結(jié)構(gòu)與功能的研究；e. 有機相中沒反應的研究；f. 酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)與應用研究；g. 抗體酶、核酸酶的研究；h. 模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成研究。26、酶的固定化方法，各自的優(yōu)缺點？答：指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。一、載體結(jié)合法： 物理吸附法 離子結(jié)合法 共價結(jié)合法二、交聯(lián)法三、包埋法 微囊型 膠囊型物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體的一種固定方法優(yōu)點：操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體；固定化過程可與純化過程同時實現(xiàn)；酶失活后載體仍可再生。缺點：吸附酶量無規(guī)律可循，對不同載體和不同酶的吸附條件不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系；酶與載體之間結(jié)合力不強，酶易于脫落，導致酶活力下降并污染產(chǎn)物 離子結(jié)合法：離子結(jié)合法是酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換的水不溶性載體上的固定化方法優(yōu)點：操作簡單、處理條件溫和，酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。缺點：載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度高的強度下進行反應時，往往會發(fā)生酶從載體上脫落的現(xiàn)象。共價結(jié)合法：共價結(jié)合法使酶以共價結(jié)合于載體上的固定化方法優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。缺點：反應條件苛刻，操作復雜，而且由于采用了比較強烈的反應條件，會引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)的變化，破壞部分活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶，甚至底物的專一性等酶的性質(zhì)也會發(fā)生變化。二、交聯(lián)法：是用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物的細胞與細胞之間交聯(lián)的固定化方法。交聯(lián)法與共價結(jié)合法一樣也是利用共價鍵固定酶的，所不同的是它不使用載體優(yōu)缺點：交聯(lián)法的反應條件比較激烈，固定化酶的酶活回收率一般比較低，但是盡可能降低交聯(lián)劑的濃度和縮短反應時間將有利于固定化酶比活的提高。一般用交聯(lián)法所得到的固定化酶顆粒小、結(jié)構(gòu)性能差、酶活性低，故常與吸附法或包埋法聯(lián)合使用。如：先用明膠包埋，在用戊二醛交聯(lián)。三、包埋法：將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)絡(luò)型，將酶或細胞包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。適于：小分子的底物和酶優(yōu)缺點：包埋法制備固定化酶的條件溫和，不改變酶的結(jié)構(gòu)，操作時保護劑及穩(wěn)定劑均不影響酶的包埋率，適用于多種酶、粗酶制劑、細胞器和細胞的固定化。27、酶固定化后有哪些變化？為什么？答： 酶活力的變化 ：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生結(jié)合，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或酶與底物結(jié)合時存在空間位阻效應。包埋法中還有底物與產(chǎn)物擴散阻力增大。 酶穩(wěn)定性的變化包括對溫度、pH、蛋白酶變性和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶構(gòu)型的牢固程度。操作穩(wěn)定性B、貯藏穩(wěn)定性C、熱穩(wěn)定性D、對蛋白酶的穩(wěn)定性 酶學特性的變化：A、底物專一性下降。B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變小pH-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關(guān)。C、最適溫度：一般升高，原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。D、米氏常數(shù)（Km）：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。E、最大反應速度（Vm）：變化很小或不定。28、主客體酶、膠束酶、分子印記酶，分子印記酶的操作流程？答：主客體酶模型：可提供一個疏水的結(jié)合部位并能與一些無機和有機分子形成包結(jié)絡(luò)合物，以此影響和催化一些反應膠束酶模型：膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境，可以對底物束縛，如果將催化基團如羥基、咪唑基、巰基和一些輔酶共價或非共價地連接或吸附在膠束上，就有可能提供活性中心部位，使膠束成為具有酶活力或部分酶活力的膠束模擬酶。分子印記酶模型：通過分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，并可以在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導產(chǎn)生催化基團，并與底物定向排列。過程：1、選定印跡分子和功能單位，讓它們之間發(fā)生互補作用，形成印跡分子功能單位復合物。2、用交聯(lián)劑在印跡分子功能單位復合物周圍發(fā)生聚合反應，形成交聯(lián)的聚合物。3、從聚合物中除去印跡分子，得到對印跡分子具有選擇