作業(yè)果膠酶的開(kāi)發(fā).doc

高產(chǎn)果膠酶菌株的開(kāi)發(fā)一，酶的介紹 果膠酶(Pectinase)是世界四大酶制劑之一，是分解果膠質(zhì)酶類的總稱，從廣義上來(lái)講，果膠酶主要分為三類:（1）原果膠酶，可以把不溶于水的原果膠分解為可溶于水的高聚合體果膠。（2）果膠酯酶，脫去果膠中的甲氧基基團(tuán)，促使果膠的脫甲酯作用。（3）解聚酶，促使果膠中的D-半乳糖醛酸的1,4糖苷鍵的裂解。天然來(lái)源的果膠酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，但動(dòng)、植物來(lái)源的果膠酶產(chǎn)量低難以大規(guī)模提取制備，微生物則是生產(chǎn)果膠酶的優(yōu)良生物資源，物中，細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌都能代謝合成果膠酶。我國(guó)學(xué)者對(duì)果膠酶菌種的選育始于上世紀(jì)80年代，研究領(lǐng)域主要集中在曲霉菌屬。目前果膠酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)尤其是果汁的提取及葡萄酒的制作，果膠酶的生產(chǎn)采取的主要方法是黑曲霉的固體發(fā)酵與液體發(fā)酵，兩者在生產(chǎn)設(shè)備及節(jié)約成本方面仍有待改進(jìn)。近年來(lái)隨著果汁與果酒行業(yè)的迅猛發(fā)展，對(duì)果膠酶的需求日益增大。篩選果膠酶高產(chǎn)菌株，優(yōu)化其發(fā)酵條件，是目前亟待研究的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)旨在誘變篩選果膠酶的高產(chǎn)菌株采用深層液體發(fā)酵法優(yōu)化其發(fā)酵條件，為實(shí)現(xiàn)果膠酶的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。 二，研究?jī)?nèi)容 菌株的篩選菌株的鑒定酶的分離純化酶學(xué)性質(zhì)研究菌種的選育酶的改性酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì) 1，菌株的篩選 (1)初篩（初復(fù)篩平板培養(yǎng)基:1oomL查氏母液+0.5g果膠+2g瓊脂糖)A.從曲阜師范大學(xué)果樹(shù)下的泥土中取土樣稱取土樣1土樣2土樣3進(jìn)行三角瓶中滅菌,并在液體培養(yǎng)發(fā)酵基中35下富集培養(yǎng)12小時(shí)B.稀釋涂布平板分別移取三個(gè)土樣的富集培養(yǎng)液0.1mL,加入裝有0.9mL無(wú)菌水的離心管中按101，102，103，104，105,106,進(jìn)行稀釋取稀釋102-106的菌懸液各0.2mL涂平板,每個(gè)梯度涂?jī)蓚€(gè)平皿,三個(gè)土樣共涂30個(gè)平皿35下恒溫培養(yǎng)3天（2） 復(fù)篩A.平板復(fù)篩初篩平板張出后，用剛果紅染色法進(jìn)行平板染色后清洗觀察透明水解圈（透明圈法較為較為簡(jiǎn)單，有效,是目前最為常用的產(chǎn)果膠酶菌株的篩選分離方法）測(cè)量菌落直徑與透明圈直徑，用接種針挑取水解圈較大若干菌落進(jìn)行劃線分離純培養(yǎng)對(duì)劃線菌落進(jìn)行編號(hào)并記錄其初篩水解圈直徑及菌落直徑水解圈直徑劃線平板于35恒溫培養(yǎng)劃線平板長(zhǎng)出后,用接種針挑取單菌落點(diǎn)種與復(fù)篩平板上,在平板背面對(duì)點(diǎn)種菌落進(jìn)行標(biāo)記,35恒溫培養(yǎng)2天,用0.05%剛果紅溶液對(duì)復(fù)篩平染色,記錄相應(yīng)菌落的菌落直徑與水解圈直徑,同時(shí)接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，測(cè)定發(fā)酵液中的果膠酶酶活2. 菌株的鑒定將篩選出的菌落直徑與水解圈較大的菌進(jìn)行純種鑒定A.觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，觀察其運(yùn)動(dòng)性，營(yíng)養(yǎng)要求及生長(zhǎng)條件。B.通過(guò)紅外光譜，氣相色譜和質(zhì)譜等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞組分。C.通過(guò)凝膠電泳的方法檢測(cè)其蛋白質(zhì)水平。D.通過(guò)16SRNA寡糖甘酸序列分析方法檢測(cè)其基因或DNA水平。3. 酶的分離純化A. 粗酶夜的制備由于產(chǎn)果膠酶菌是胞外酶產(chǎn)生菌，所以利用差速離心法去除培養(yǎng)液中的菌體B.硫酸銨鹽析將制的的粗酶夜通過(guò)硫酸銨鹽析沉淀（Kiyoshy等人采用85%飽和度的硫酸銨鹽析從白絹病菌中提取了聚半乳糖醛酸酶,其純化了 8倍,酶收率為52%。酶收率相對(duì)較高，故采用此法）C.層析果膠酶通過(guò)硫酸錢鹽析之后,可以利用離子交換層析法對(duì)其進(jìn)行更深一步的提純。4. 酶學(xué)性質(zhì)研究 A.最適作用pH分別用不同pH值(2.0一8.0)的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液配制一定濃度的果膠溶液,按常規(guī)條件測(cè)定酶活。pH穩(wěn)定性測(cè)定；將上述不同pH的緩沖液分別在設(shè)定的不同溫度下處理2h后，再次測(cè)其酶活。B.最適作用溫度試管中加入0.5ml,pH值4.2的l%果膠,預(yù)熱5min,加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液0.5ml,分別在35一65水浴條件下反應(yīng)30min,測(cè)其酶活。50ml燒杯中加入4.0ml,pH值4.0的1%果膠,預(yù)熱5min,加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液1.0ml,分別在35一65水浴條件下反應(yīng)60min,測(cè)定酶活。對(duì)熱穩(wěn)定性：粗酶液分別在3060C之間水浴中保溫20min,立即冰浴,然后按常規(guī)條件測(cè)定三種果膠酶酶活。C.金屬離子對(duì)酶活的影響在酶液中加入金屬離子母液,使各金屬離子的終濃度均為5mol/L,室溫下靜置30min,測(cè)定金屬離子存在下的PG酶活力,以未加金屬離子實(shí)驗(yàn)組的酶活力為100%。5. 菌種的選育結(jié)合山東省盛產(chǎn)梨的實(shí)際情況，將梨皮粉作為培養(yǎng)基的主要碳源進(jìn)行菌株的選育將蛋白胨，無(wú)機(jī)離子，水，梨皮粉配制成液體培養(yǎng)基，將之前獲得的透明圈直徑較大的混合菌進(jìn)行液體培養(yǎng)在三角瓶中搖床培養(yǎng)23天取出菌液再放入梨皮粉含量高的液體培養(yǎng)基中，并在搖床中培養(yǎng)2-3天，取出菌液。利用稀釋涂布平板法將上述菌液接種到查式母液培養(yǎng)基上，使其在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其長(zhǎng)出菌落。6. 對(duì)酶的改性利用蛋白工程方法對(duì)酶進(jìn)行改造，使其能夠適應(yīng)發(fā)酵工廠的大規(guī)模生產(chǎn)。用此法可以有效快速地對(duì)酶進(jìn)行改造，效果明顯。7. 酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)選用膜反應(yīng)器進(jìn)行酶膜反應(yīng)器的設(shè)計(jì)，酶在反應(yīng)容器中反應(yīng)后，將反應(yīng)液導(dǎo)出到膜分離器中，小分子的反應(yīng)產(chǎn)物透過(guò)超濾膜排出，大分子的酶被超濾膜截留，再循環(huán)使用。一則可以將酶回收，循環(huán)使用；二則可以將產(chǎn)物及時(shí)的分離