淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告.doc

班級(jí)：植物092 姓名：徐煒佳 學(xué)號(hào)：0901080223淀粉酶活性的測(cè)定一、研究背景及目的酶是高效催化有機(jī)體新陳代謝各步反應(yīng)的活性蛋白，幾乎所有的生化反應(yīng)都離不開(kāi)酶的催化，所以酶在生物體內(nèi)扮演著極其重要的角色，因此對(duì)酶的研究有著非常重要的意義。酶的活力是酶的重要參數(shù)，反映的是酶的催化能力，因此測(cè)定酶活力是研究酶的基礎(chǔ)。酶活力由酶活力單位表征，通過(guò)計(jì)算適宜條件下一定時(shí)間內(nèi)一定量的酶催化生成產(chǎn)物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱，按照其水解淀粉的作用方式，可分為-淀粉酶和-淀粉酶等。-淀粉酶和-淀粉酶是其中最主要的兩種，存在于禾谷類的種子中。-淀粉酶存在于休眠的種子中，而-淀粉酶是在種子萌發(fā)過(guò)程中形成的。-淀粉酶活性是衡量小麥穗發(fā)芽的一個(gè)生理指標(biāo),-淀粉酶活性低的品種抗穗發(fā)芽,反之則易穗發(fā)芽。目前,關(guān)于-淀粉酶活性的測(cè)定方法很多種,活力單位的定義也各不相同,國(guó)內(nèi)外測(cè)定-淀粉酶活性的方法常用的有凝膠擴(kuò)散法、3,5-二硝基水楊酸比色法和降落值法。這3種方法所用的材料分別是新鮮種子、萌動(dòng)種子和面粉,獲得的-淀粉酶活性應(yīng)該分別是延遲(內(nèi)源)-淀粉酶、萌動(dòng)種子-淀粉酶和后熟面粉的-淀粉酶活性。測(cè)定方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)DNS靈敏、準(zhǔn)確、精確度高,適宜精確測(cè)量小樣品-淀粉酶活性大小測(cè)定步驟較繁,不便分析大量樣品,測(cè)定范圍較窄凝膠擴(kuò)散法簡(jiǎn)便、快速、省時(shí)、省力,消耗材料和藥品較少,不需要特殊儀器,測(cè)定范圍較寬邊界不清晰,靈敏度與準(zhǔn)確度較低,不適宜精確測(cè)量-淀粉酶活性的大小降落值法快速、省時(shí)、重現(xiàn)性好、平行性好、消耗的藥品少,適宜于測(cè)量大量樣品消耗的材料多,間接測(cè)定-淀粉酶活性大小本實(shí)驗(yàn)的目的在于掌握-淀粉酶和-淀粉酶的提取和測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理萌發(fā)的種子中存在兩種淀粉酶，分別是-淀粉酶和-淀粉酶，-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下則發(fā)生鈍化。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)利用-淀粉酶不耐熱的特性，在高溫下（70）下處理使得-淀粉酶鈍化而測(cè)定-淀粉酶的酶活性。酶活性的測(cè)定是通過(guò)測(cè)定一定量的酶在一定時(shí)間內(nèi)催化得到的麥芽糖的量來(lái)實(shí)現(xiàn)的，淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸試劑測(cè)定，由于麥芽糖能將后者還原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團(tuán)，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時(shí)間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測(cè)得兩種淀粉酶的總活性。實(shí)驗(yàn)中為了消除非酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來(lái)的誤差，每組實(shí)驗(yàn)都做了相應(yīng)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在最終計(jì)算酶的活性時(shí)以測(cè)量組的值減去對(duì)照組的值加以校正。在實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格控制溫度及時(shí)間，以減小誤差。并且在酶的作用過(guò)程中，四支測(cè)定管及空白管不要混淆。三、材料、試劑與儀器實(shí)驗(yàn)材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)1厘米左右）儀器：722光柵分光光度計(jì)(編號(hào)990695) DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(編號(hào)L-304056) 離心機(jī)(TDL-40B) 容量瓶：50ml1，100ml1小臺(tái)秤研缽具塞刻度試管：15ml6試管：8支移液器燒杯試劑： 1%淀粉溶液（稱取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸餾水，加熱熔解，冷卻后定容至100ml）； pH5.6的檸檬緩沖液：A液（稱取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液； 3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml 1M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋保存）； 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（稱取0.100克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； 0.4M NaOH四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 酶液的制備稱取2克萌發(fā)的小麥種子與研缽中，加少量石英砂，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，混勻后在室溫下放置，每隔數(shù)分鐘振蕩一次，提取15-20分鐘，于3500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液備用。2.-淀粉酶活性的測(cè)定 取4支管，注明2支為對(duì)照管，另2支為測(cè)定管 于每管中各加酶提取液液1ml，在70恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應(yīng)超過(guò)0.5）準(zhǔn)確加熱15min，在此期間-淀粉酶鈍化，取出后迅速在冰浴中徹底冷卻。 在試管中各加入1ml檸檬酸緩沖液 向兩支對(duì)照管中各加入4ml 0.4M NaOH，以鈍化酶的活性 將測(cè)定管和對(duì)照管置于40（0.5）恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫15min再向各管分別加入40下預(yù)熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即放入40水浴中準(zhǔn)確保溫5min后取出，向兩支測(cè)定管分別迅速加入4ml 0.4M NaOH,以終止酶的活性，然后準(zhǔn)備下步糖的測(cè)定。3. 兩種淀粉酶總活性的測(cè)定取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（稀釋倍數(shù)視樣品酶活性大小而定，一般為20倍）?；旌暇鶆蚝?，取4支管，注明2支為對(duì)照管，另2支為測(cè)定管，各管加入1ml稀釋后的酶液及pH5.6檸檬酸緩沖液1ml，以下步驟重復(fù)-淀粉酶測(cè)定的第及第的操作。4. 麥芽糖的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取15ml具塞試管7支，編號(hào)，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，用蒸餾水補(bǔ)充至1.0ml，搖勻后再加入3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確保溫5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計(jì)于520nm波長(zhǎng)下比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定 取15ml具塞試管8支，編號(hào)，分別加入步驟2和3中各管的溶液各1ml，再加入3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計(jì)于520nm波長(zhǎng)下比色，記錄消光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。五、數(shù)據(jù)整理及計(jì)算麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度mg/ml00.10.30.50.70.91.0OD520項(xiàng)目 (測(cè))(測(cè))(對(duì))(對(duì))+(測(cè))+(測(cè))+(對(duì))+(對(duì))OD520平行組數(shù)據(jù)均值OD520 樣品麥芽糖濃度mg/ml 上表中前4行數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)。以表中前兩行數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)下頁(yè)），計(jì)算上表中第4行數(shù)據(jù)（各樣品的OD值）均值，填入上第5行中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，計(jì)算第5行OD值所對(duì)應(yīng)的麥芽糖濃度，填入最后一行，如上表。根據(jù)以上的數(shù)據(jù)整理的結(jié)果，結(jié)合以下公式計(jì)算兩種淀粉酶的活性：A-淀粉酶測(cè)定管中的麥芽糖濃度A-淀粉酶對(duì)照管中的淀粉酶的濃度B(-+-)淀粉酶總活性測(cè)定管中的麥芽糖濃度B(-+-)淀粉酶總活性對(duì)照管中的麥芽糖濃度計(jì)算結(jié)果如下： -淀粉酶活性= （毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1） (-+-)淀粉酶活性= （毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1）-淀粉酶活性= （毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1）六、結(jié)果分析七、思考題1、酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)思路是什么？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵你認(rèn)為是什么？為什么？答：利用酶的專一性或酶活力的影響因素抑制除待測(cè)酶以外的其它酶活性，通過(guò)測(cè)酶促反應(yīng)的產(chǎn)率推算酶活力大小。關(guān)鍵在于抑制其它酶的活力而不影響測(cè)定酶，這樣可以減小或避免其它酶產(chǎn)物給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)的誤差。2、本實(shí)驗(yàn)最易產(chǎn)生對(duì)結(jié)果有較大誤差影響的操作是哪些步驟？為什么？怎樣的操作策略可以盡量減少誤差？答：浸提步驟。70溫度或15min時(shí)間控制不嚴(yán)格不準(zhǔn)確則可能導(dǎo)致淀粉酶未完全鈍化使測(cè)得活性偏大。應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間。70水浴后需要立即冰浴，否則淀粉酶復(fù)性使測(cè)得淀粉酶活性結(jié)果偏大。向測(cè)定管中加入NaOH時(shí)應(yīng)迅速，否則酶與底物繼續(xù)反應(yīng)使結(jié)果偏大。3、a-淀粉酶活性測(cè)定時(shí)70水浴為何要嚴(yán)格保溫15分鐘？保溫后為何要立即于冰浴中驟冷？答：由于b-淀粉酶不耐熱，在70下處理一定時(shí)間可以鈍化，嚴(yán)格保溫15分鐘可以達(dá)到理想的鈍化效果，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，a-淀粉酶活性也會(huì)受到影響；時(shí)間不足，b-淀粉酶鈍化不完全。保溫后立即驟冷是為了通過(guò)劇烈的溫變改變b-淀粉酶的結(jié)構(gòu)以防止在隨后的反應(yīng)中復(fù)性，這樣就保證了在隨后的40溫浴的酶促反應(yīng)中b-淀粉酶不會(huì)再參與催化反應(yīng)。此外我認(rèn)為冰浴使酶迅速降溫，便于嚴(yán)格控制高溫處理時(shí)間的長(zhǎng)短。4、pH5.6檸檬酸緩沖液的作用？各管于40水浴準(zhǔn)確保溫15分鐘的作用？答：酶實(shí)驗(yàn)體系的pH值變化或變化過(guò)大，會(huì)使酶活性下降甚至完全失活。加入pH5.6的緩沖液調(diào)至酶促反應(yīng)的最適pH，同時(shí)穩(wěn)定溶液的pH不至于在反應(yīng)過(guò)程中大幅波動(dòng)。40水浴準(zhǔn)確保溫15分鐘為調(diào)整酶促反應(yīng)的最適溫度5、眾多測(cè)定淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均采取鈍化b-淀粉酶的活力而測(cè)a-淀粉酶和測(cè)總酶活力的策略，為何不采取鈍化a-淀粉酶活力去測(cè)b-淀粉酶活力呢？這種設(shè)計(jì)思路說(shuō)明什么？答：淀粉酶與淀粉酶的催化特性是有差異的。淀粉酶主要作用于直鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，而且僅從淀粉分子外圍的非還原性末端開(kāi)始，切斷至-1,6-鍵的前面反應(yīng)就停止了；而淀粉酶則無(wú)差別地作用于直鏈淀粉與支鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，所以淀粉酶需要淀粉酶淀粉支鏈的-1，4-糖苷鍵后才能完全體現(xiàn)其催化能力。此外我認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中溫度比酸度更易控制，鈍化淀粉酶難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于淀粉酶，而且若提高酸度鈍化淀粉酶，則回調(diào)最適pH時(shí)淀粉酶也有可能由于復(fù)性恢復(fù)活力。這種設(shè)計(jì)思路說(shuō)明在測(cè)定酶的比活力時(shí)要綜合考慮各種可能出現(xiàn)的酶的性質(zhì)以及它們之間的聯(lián)系，也要考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性。6、本實(shí)驗(yàn)中所設(shè)置的對(duì)照管的作用？它與比色法測(cè)定物質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的空白管有何異同？本實(shí)驗(yàn)可否用對(duì)照管調(diào)分光光度計(jì)的100%T？為什么？答：消除非酶促反應(yīng)（如淀粉酸性環(huán)境下加熱水解）和非測(cè)定時(shí)間內(nèi)的酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來(lái)的誤差。兩種都是為了消除非測(cè)定部分對(duì)光的吸收，空白組是為了消除溶液中溶劑等其它組分對(duì)光的吸收，而對(duì)照管是為了消除非測(cè)量所需反應(yīng)所得的多余溶質(zhì)對(duì)光的吸收。不可，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線的確定是在空白的基礎(chǔ)上的，得到的是OD值與麥芽糖含量的關(guān)系7、我們所測(cè)定得到的總酶活力減去所測(cè)定得到的a-淀粉酶活力是否就等于b-淀粉酶活力？為什么？你的結(jié)論說(shuō)明什么？答：不等于。因?yàn)榈矸勖负偷矸勖缸饔糜?1,4糖苷鍵，但二者都不能水解支鏈的-1，6-糖苷鍵，而我們所測(cè)定得到的總酶活力是二者在與R酶的共同作用下測(cè)得的酶活力，R酶能夠降解支鏈淀粉，斷裂-1,6-糖苷鍵，從而增大了淀粉酶和淀粉酶可水解的底物濃度，使測(cè)得的總活力大于淀粉酶和淀粉酶單獨(dú)作用的酶活力之和。我的結(jié)論說(shuō)明實(shí)驗(yàn)時(shí)要考慮各種酶協(xié)同作用的綜合因素 七、參考文獻(xiàn)1生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)自編教材2基礎(chǔ)生物化學(xué) 趙武玲 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社3 岳海鳳1,2,郜慶爐2,薛香2 小麥-淀粉酶活性測(cè)定方法比較(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南鄭