純化系統(tǒng)（AutoPurification System）.ppt

純化系統(tǒng) AutoPurificationSystem 制備色譜簡介 2 一 色譜發(fā)展和制備色譜分類二 制備色譜基本理論三 制備型高效液相色譜四 Waters純化系統(tǒng)操作規(guī)程五 應(yīng)用實例 3 一 色譜發(fā)展和制備色譜分類 4 1980s 1950s 1903 色譜發(fā)展史 1938 茨維特 一種新型的吸附現(xiàn)象及其在生化分析中的應(yīng)用 Kuhn和Lederer從維生素B中分離出B6獲得了1938年的諾貝爾化學(xué)獎 1940s 1941年 Martin和Synge提出液液分配色譜法 塔板理論1942年 Martin等發(fā)展了紙色譜 1952年 Martin和James提出氣液分配色譜法 諾貝爾獎1956年 VanDeemter色譜速率理論 用于氣相色譜1958年 Golay提出毛細(xì)管柱氣相色譜 1962年 Klesper提出超臨界流體色譜1963年 Giddings奠定了現(xiàn)代液相色譜理論基礎(chǔ)60年代中后期 逆流色譜 凝膠滲透色譜 親和色譜1969年 現(xiàn)代液相色譜受到重視 高速逆流色譜出現(xiàn)毛細(xì)管電泳發(fā)展 2000s 超高效液相色譜多維分離聯(lián)用技術(shù) 5 模擬移動床色譜 高速逆流色譜 高壓制備色譜 低壓及中壓制備色譜 經(jīng)典柱色譜 制備薄層色譜 制備色譜分類 吸附柱色譜 離子交換色譜 凝膠柱色譜 親和柱色譜 干柱色譜 分配柱色譜 低壓 0 5Mpa中壓 0 5 2Mpa 固定相不需要載體制備型分離重點兩相溶劑系統(tǒng)的選擇 石油工業(yè)和糖工業(yè)尤適用于兩組分混合物分離 6 二 制備色譜基礎(chǔ)理論 7 分析和制備有什么異同 制備方法中關(guān)注的參數(shù)有哪些 如何選擇制備柱的尺寸 如何做到分析到制備的線性放大 制備中難點有哪些 8 9 色譜的基本理論及有關(guān)參數(shù) 兩大理論 塔板理論 闡明了色譜 蒸餾和萃取之間的相似性 將色譜柱設(shè)想成由許多液液萃取單元或理論塔板組成 相似于精餾過程 色譜分離也是一個分配平衡過程 N 16 tR wb 2N 5 54 tR w1 2 2速率理論 研究各種動力學(xué)因素對峰展寬的影響 H A B u Cu 10 相關(guān)參數(shù) 分離度 分辨率 在色譜分離過程中表示兩組分相互分離的程度 一般情況下 分離度大于1 5時稱為完全分離 11 只有峰窄而間距大的分離度是令人滿意的 在色譜分析中要求 兩組分的保留值差別要足夠大兩色譜峰要足夠窄待測組分的分離度要足夠大 分離過程要盡可能短 相關(guān)參數(shù) 理論塔板數(shù) N 描述色譜峰譜帶展寬的程度 是物理因素 N 16 tR W 2選擇因子 描述兩個被分離組份分離的好壞程度 是化學(xué)因素 tR2 tR1 容量因子 k 表達(dá)了被分離組分與柱填料之間作用的強(qiáng)弱 k tR t0 t0 12 分離因子 柱效 容量因子對分離的影響 相關(guān)參數(shù) 13 上樣量 Capacity 純化過程中 目標(biāo)物質(zhì)的上樣量 可以是體積也可以是質(zhì)量 回收率 Recovery 產(chǎn)品貴重時此項很重要 流動相的條件 環(huán)境會影響它 分離度 Resolution 在純化的最后階段 此項很關(guān)鍵 尤其是雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和目的物結(jié)構(gòu)相似時 14 相關(guān)參數(shù) 15 制備規(guī)模 16 分析放大到制備 17 分析放大到制備 確定樣品信息 樣品性質(zhì)組成 基體 復(fù)雜性 性質(zhì) 相態(tài) 濃度 價值 產(chǎn)品純度微量天然產(chǎn)物 70 核磁或者紅外測試的樣品 95 以上定量分析用的標(biāo)準(zhǔn)品 99 以上 18 分析放大到制備 開發(fā)分析級分離方法 良好的分離選擇性 足夠的柱效N合適的溶劑強(qiáng)度 容量因子k 19 分析放大到制備 增加進(jìn)樣量 過載 體積過載 制備色譜上樣量應(yīng)控制在組分峰的容量因子下降10 左右 流動相中溶液濃度 質(zhì)量過載 20 分析放大到制備 放大為制備級方法 上樣量 流速 梯度坡度 S constant Changein organicVm VolumeofthecolumntG GradienttimeF Flow 21 分析放大到制備 測定純度 除去組分中的溶劑 氮吹 旋蒸 冷凍干燥純度 HPLC TCL 回收率 重量 活性 22 制備中的難點 相互制約的 三角形 23 制備中的難點 上樣量 選擇的流動相好的分離度 較高的溶解度進(jìn)樣體積增大至最大進(jìn)樣體積了解樣品的性質(zhì)如對離子型樣品改變pH或者緩沖鹽的濃度改變?nèi)芙鈽悠返娜軇┤缂状?DMSO等 前提保證分離度 溫度 待分離成分呈單一主峰不易分開的兩組分目的組分含量少 24 制備中的難點 分離度 待分離成分呈單一主峰 25 目的組分含量少 26 樣品量對主峰前面微量組分峰寬的影響 樣品量對主峰前面微量組分峰寬的影響 不易分開的兩組分 27 28 三 純化系統(tǒng) Autopurification 29 輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)餾分收集系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 純化系統(tǒng) 30 輸液系統(tǒng) 單向閥 A B 過濾器 31 輸液系統(tǒng) 單向閥故障單向閥堵死 液體不出來 壓力無顯示單向閥被污染 壓力波動大處理方法 純水超聲10min 甲醇超聲15min 過濾器故障過濾器堵塞 壓力升高處理方法 純水超聲10min 甲醇超聲15min 32 進(jìn)樣系統(tǒng) 33 色譜柱 34 檢測系統(tǒng) 紫外檢測器蒸發(fā)光散射檢測器質(zhì)譜檢測器 35 餾分收集系統(tǒng) UVFractionManager Waters2767SampleManager WatersAutoPurificationSystem操作規(guī)程 操作程序 開機(jī) 首先準(zhǔn)備新鮮流動相 洗針溶液和洗泵溶液T1為弱洗 與初始流動相條件相同 T2為強(qiáng)洗 樣品溶解度較好的溶劑 sealwash 10 MeOH 90 H2O 打開計算機(jī)電源 進(jìn)入windows操作系統(tǒng)打開檢測器 2767 2545BSM 515泵等待儀器通過自檢后在打開Masslynx軟件 登錄Masslynxv4 1軟件 進(jìn)入運(yùn)行樣品界面 點擊Fractionlynx CollectionControl 將Fractionlynx激活 設(shè)置收集位置 新建Project File ProjectWizard Yes 輸入Project名稱 建每個使用人員用個人的名稱 Description 可根據(jù)需要選擇是否填寫 點擊 next 如已建Project 則打開自己的Project Flie OpenProject Yes 制備常用的Samplelist Samplelist各參數(shù)含義 編輯samplelist 從該表格中選出需要的參數(shù) 保存samplelist InletFile 在InletFile方法框中任選一方法 點擊鼠標(biāo)右鍵 選擇 edit InletMethod Inlet Inlet 選擇溶劑 A1 B1或A2 B2 編輯梯度方法設(shè)置壓力限制 pressurelimits 設(shè)置運(yùn)行時間 runtime Autosampler 選擇進(jìn)樣口 分析或制備選擇進(jìn)樣方式 Particallooporfullloop選擇是否將樣品打入定量環(huán)中央選擇洗針方式Aferinjectororaftercollection Detector 選擇掃描波長注意運(yùn)行時間和液相時間一致 保存InletFile InletFile的調(diào)用 進(jìn)樣位置設(shè)置 bottle 編輯FractionFile 右鍵 edit General FractionDectectionFraction 可選擇on或offPeak 峰的類型analysis或preparativeMultipleFractionsMax Fractionsper 最大收集組分?jǐn)?shù)Max Tubesper 最大收集管數(shù)RinseBetweenFractions Rinsetime 收集口清洗時間 0 10s Timing SolventFrontDelay 如果想忽略前面的溶劑峰 可設(shè)置一個solventfrontdelaytime 0to6000seconds Split CollectorDelay 延遲時間 需要測定 不同的流速有不同的延遲時間 MinimumFraction 最小組分寬度Time 0to300secondsVolume 0to1000mLor0to1000tubesRecommendation 3secondsMaximumFraction 最大組分寬度Time 0to600seconds dependentonchromatography Volume 0to100mLVolume tubes MaximumTubeFill 試管體積百分?jǐn)?shù)0to100 MumberofFractionsto UV Min IntensityThreshold 最小閾值Max Intensity 最大閾值Peakstart UseMITOnly 根據(jù)上面設(shè)的閾值LeadingEdgeGradient Specifytheminimumgradientrequiredtostartfractioncollectionbyspecifyingoneofthesevalues 50 1 5times100 2 0times200 3 0timesPeakstart BelowGradient 0 100 UseMaxFractionWidth UseMITonly TrailingValley Totriggerpeakterminationbasedonadownwardslope enteravaluelessthan0 Totriggerterminationclosetothevalley enter0 Totriggerpeakterminationbasedonanupwardslope enteravaluegreaterthan0 Timedevents Disable EnableCollect Anypeaksdetectedafterdisablingfractioncollectionandbeforeenablingcollectionarenotcollected Atthestartofarun collectionisalwaysenabled 與前面設(shè)置的閾值相關(guān) 只有達(dá)到閾值才收集Start StopCollect 跟時間有關(guān)跟前面的閾值無關(guān)UVMIT 閾值的時間事件 保存FractionlynxMethod FractionTrigger1 2 選擇需要按照何種模式觸發(fā)收集 在FractionTrigger中雙擊可以進(jìn)行選擇WavelengthA B 選擇需要檢測的波長