乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗方法.doc

乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗方法前言乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）是由乙型肝炎病毒（HepatitisB virus , HBv ）引起的傳染性疾病，在我國人群中感染率較高，是嚴重危害人民身體健康的常見傳染病之一。對乙肝的診斷主要以實驗室檢測乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface antigen , HBsAg ）為主，檢測方法主要有酶免疫法、反向間接血凝法、放免法、化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法等，目前應(yīng)用較廣、較普及的是酶免疫法。本標準所使用的縮略語為HBV 、HBsAg 。本標準從2002 年7 月1 日起實施。本標準由衛(wèi)生部醫(yī)政司提出。本標準由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部人民醫(yī)院肝病研究所負責(zé)起草。本標準主要起草人：陶其敏、全文斌。本標準由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部臨床檢驗中心負責(zé)解釋。中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準中華人民共和國衛(wèi)生部2002-04-20 批準 2002-07-01 實施乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗方法WS / T 223 一2002 Guidelines for enzyme immuno 一assay of hepatitis B surface antigen 1 范圍本標準規(guī)定了血清HBsAg 酶免疫檢驗方法（兩步法）中相關(guān)的技術(shù)要求。本標準適用于各基礎(chǔ)、臨床實驗室和流行病學(xué)研究中血清HBsAg 測定。2 方法選擇2 . 1 常用方法HBsAg 的酶免疫檢驗方法根據(jù)反應(yīng)模式可分為“一步法”和“兩步法”兩種方法?！耙徊椒ā笔菍⒋郎y樣品和酶標記抗體同時加人到反應(yīng)孔中進行反應(yīng)，從而達到快速的目的；“兩步法”則是先將樣品加人到反應(yīng)孔中，待反應(yīng)結(jié)束后再加人酶標記抗體，從而使待測樣品的“捕獲反應(yīng)”和酶標記抗體的“酶聯(lián)反應(yīng)”分開進行，因而反應(yīng)更加穩(wěn)定、重復(fù)性也更好。2 . 2 推薦方法由于“一步法”存在產(chǎn)生“前帶現(xiàn)象”的可能，故在本標準中不列為推薦方法；本標準推薦使用酶免疫“兩步法”。2 . 3 方法原理本標準推薦使用酶免疫“兩步法”檢測HBsAg ：將抗HBs 的單克隆抗體（簡稱單抗）或多克隆抗體（簡稱多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相載體上，加人待測血清，如其中含有HBsAg ，則可與固相上的包被抗體結(jié)合；洗板去除不參加反應(yīng)的無關(guān)蛋白成分后，加人酶（如辣根過氧化物酶）標記的第二株抗體使之與血清中HB 、Ag 反應(yīng)，在固相載體上形成包被抗體一血清中HBsAg 一酶標記抗體的復(fù)合物（即雙抗體夾心）；再加人底物后，酶催化底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色反應(yīng)顏色的深淺可判定血清樣品中HB 、Ag 的有無及相對含量。3 試劑和材料國內(nèi)目前已有成套的試劑盒供應(yīng)。顯色反應(yīng)底物液可選用鄰苯二胺（o-phenylenediamine 。OPD）過氧化氫（H202 。）溶液（簡稱OPD ）或3 , 3 , 5 , 5 -四甲基聯(lián)苯胺（3 , 3 , 5 , 5 一Tetramethylbenzidine , TMB ）-H2O2 溶液（簡稱TMB ）。使用OPD 時，可選用2mol / l的硫酸（H2SO4 ）作為終止液，比色時選用492nm 作為測定波長；使用TMB 時，可選用2 mol / l的鹽酸或2 mol / l 的硫酸溶液作為終止液，比色時選用450 nm 作為測定波長。注:國內(nèi)市場目前亦有HBsAg 檢測的快速酶免疫試劑盒供應(yīng)，該試劑盒系加有標本加速劑和酶標記抗體加速劑，可達到快速反應(yīng)的目的，具體操作方法詳見各生產(chǎn)廠家的試劑盒說明書。4 儀器和設(shè)備包括酶標儀、移液系統(tǒng)（移液器及移液器頭）和恒溫設(shè)備（水浴箱）等。所選用的儀器設(shè)備應(yīng)滿足以下要求：a ）酶標儀在450 nm 和492 nm 的波長不精密度應(yīng)在1 %，分別在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之間，吸光度（A 值）要求可以測到小數(shù)點后兩位；b ）移液系統(tǒng)在100l和50 l 的移液不精密度應(yīng)1 % ，分別在99- 101l 和49.5l-50.5l 之間；c ）恒溫系統(tǒng)在37 、43 的溫度變異應(yīng)成士I 。樣品5 . 1 血液樣品的采取取受試者的前臂靜脈血。止血帶的使用時間應(yīng)不超過1 min ，同時避免溶血。5 . 2 血液樣品的處理、貯存和測定前準備血液樣品采取后室溫下靜置30 min-45 min 使其凝血，避免溶血，2 O00r / min 離心5 min 后立刻吸出血清置密封的試管中貯存。分離出的血清標本可于2-4 貯存1 周，如需貯存更長時間，則應(yīng)保存在-20 以下，用時提前取出融化并使其溫度升至室溫，充分混勻后測定。保存在20 的標本應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則可能會影響測定結(jié)果的準確性。注：HBsAg 的檢測亦可用血漿類標本，其抗凝劑可選用拘椽酸鈉（106 mmol / L 的水溶液與血液按1： 9 比例使用）、乙二胺四乙酸二鈉（15g / l ，的水溶液與血液按1： 9 比例使用）、肝素（100 u / mg 125 u / mg 的肝素鈉粉劑配成1g/L的水溶液與血液按1 : 9 比例使用）等。6 測定步驟6 .1測定前準備將貯存的成套試劑盒及待測血清樣品取出，使其溫度升至室溫后混勻使用。準備或開啟儀器設(shè)備。6 . 2 測定操作a ）已包被好的微孔反應(yīng)板中每孔加人待測血清100l ，每次實驗均應(yīng)設(shè)陰性、陽性對照及空白孔，37C 水浴或恒溫箱保溫2h 或43C 保溫lh ; b ）洗板3-5 次，每次均將各孔中注滿洗液，靜置20s以上，傾去液體，拍干；c ）每孔中加人酶標記的抗體100l ，保溫同前，洗板3-5 次，同前；d ）每孔加人顯色底物液100l , 37C 避光反應(yīng)15 min -20 min 后加人終止液50l。）酶標儀測定結(jié)果。測定結(jié)果的表述和有效性判斷7 . 1 測定結(jié)果的表述加人終止液后，用空白孔校零，再讀取各孔的A 值，凡標本的A 值陰性對照均值 2 . 1 者判定為HBsAg 陽性，反之為陰性。72 測定結(jié)果的有效性判斷陰性對照及陽性對照孔所測A 值應(yīng)在試劑盒的要求范圍內(nèi)，否則應(yīng)分析原因后重新測定。注1所得結(jié)果應(yīng)表示至小數(shù)點后2 位；2陰性對照均值為陰性對照各孔所測定A 值的均值，其CV 值應(yīng)15 % ; 3 陰性對照均值 0.05 時按實測值計算。8 靈敏度、精密度和特異性8 .1靈敏度本方法的靈敏度一般應(yīng)1 ng / ml ,應(yīng)可檢側(cè)出adr 、adw 、ayw 三種亞型的HBsAg 。8 . 2 精密度應(yīng)用本方法對同一份樣品進行檢測（ 10 孔），批內(nèi)CV值應(yīng)15 。8 . 3 特異性血清樣品中的抗壞血酸、血紅蛋白