葛根提取物樣品中總黃酮和葛根素含量的測定.doc

葛根提取物樣品中總黃酮和葛根素含量的測定一、 實(shí)驗(yàn)背景介紹1. 黃酮類化合物的定義、結(jié)構(gòu)與分類黃酮類化合物是在植物中分布非常廣泛的一類天然產(chǎn)物。此類化合物多為黃色，且具有酮式羰基，故稱黃酮類化合物。1952年以前，黃酮類化合物主要是指基本母核為2-苯基色原酮的一系列化合物。峰帶II，220280 nm A環(huán)苯甲?；到y(tǒng)峰帶I，300400 nm B環(huán)桂皮?；到y(tǒng)色原酮 2-苯基色原酮（黃酮）現(xiàn)在的黃酮類化合物則泛指兩個(gè)苯環(huán)（A與B環(huán)）通過中央三碳鏈相互連接而成的一類化合物。 C6-C3-C6黃酮類化合物的苷元的結(jié)構(gòu)類型根據(jù)三碳鏈氧化程度、B環(huán)（苯基）連接位置（2-位或3-位）以及三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀可分為黃酮、異黃酮、二氫黃酮、查爾酮、花色素、橙酮類、黃烷醇類等。2.葛根及其所含黃酮的功能介紹葛根為豆科植物野葛的干燥根，其味甘、辛、性平，既是中藥材又是營養(yǎng)豐富的食用原料。葛根是我國一種傳統(tǒng)中藥，對于葛根的藥用價(jià)值早在神農(nóng)本草經(jīng)中就有記載，葛根具有解痙退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功能。黃酮類化合物是葛根中的主要活性類成分之一，同其它大多數(shù)黃酮類化合物相似，葛根黃酮類化合物也具有多種藥理功能，如改善血液循環(huán)、降血壓、降血糖、降血脂、抑制動(dòng)脈硬化，抗心率失常，抗血小板聚集、抗腫瘤、抗缺氧與抗氧化等。此外，葛根目前己被衛(wèi)生部認(rèn)定為藥食兩用的山地植物。葛根素是從葛根中所提取得到的一種異黃酮類化合物，是葛根總黃酮中的一種。實(shí)驗(yàn)證明其有擴(kuò)張心腦血管，降低心肌氧耗，改善心肌收縮功能和促進(jìn)血液微循環(huán)作用，可用于治療冠心病、視網(wǎng)膜動(dòng)、靜脈阻塞和突發(fā)性耳聾等微循環(huán)障礙病?；谏鲜鲲@著的藥用價(jià)值，對葛根提取物中總黃酮以及葛根素含量的測定具有重要的意義。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 了解雙光束紫外可見分光光度計(jì)和高效液相色譜的基本結(jié)構(gòu)，并掌握相應(yīng)的基本操作2. 能夠通過化合物的紫外光譜掃描曲線，選擇合適的測定波長3. 掌握高效液相色譜法定性定量分析的基本原理4. 學(xué)習(xí)葛根提取物中總黃酮和葛根素的測定方法三、實(shí)驗(yàn)原理1. 總黃酮含量的測定原理大多數(shù)黃酮類化合物分子中存在桂皮?；捅郊柞；M成的交叉共軛體系，其在200400 nm波長的區(qū)域內(nèi)存在兩個(gè)紫外吸收帶，即位于帶(300400 nm)和帶(240280 nm)。其中帶的吸收峰較強(qiáng)，是定量分析的重要依據(jù)，可采用紫外分光光度法測定樣品中總黃酮類化合物的含量。由于葛根素是葛根中含量較多且具有代表性的一種黃酮，因而常以其為參考標(biāo)準(zhǔn)來測定葛根及其附加產(chǎn)品中總黃酮的含量。2. 葛根素含量的測定原理葛根提取物中的組份較多，具體到葛根素的測定，則首先應(yīng)將其與其他組分分離開來再進(jìn)行測定，而高效液相色譜法是天然產(chǎn)物分離分析的重要手段，可通過優(yōu)化色譜操作條件實(shí)現(xiàn)葛根素的分離和測定。根據(jù)色譜定性原理，即同一種物質(zhì)在相同色譜操作條件下的保留時(shí)間一致，通過與葛根素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的對比，來確定提取物色譜圖中的葛根素色譜峰。根據(jù)色譜定量分析的原理，即在相同的色譜操作條件下，色譜峰的峰面積與待測物質(zhì)的濃度成正比，依此可測定葛根素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由提取物溶液中葛根素的峰面積求出相應(yīng)的濃度，最終計(jì)算出提取物中葛根素的含量。四、 主要儀器與試劑主要儀器：TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)；Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀（配有UV檢測器和chromeleon色譜工作站），分析天平；超聲波清洗器。主要試劑：1.0 mg/mL葛根素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（體積比為30/70的乙醇水做溶劑）；葛根提取物A；葛根提取物B；甲醇（色譜純）；無水乙醇（分析純）；超純水 五、實(shí)驗(yàn)步驟1. 葛根提取物中總黃酮含量的測定（1）精密量取0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至于100 mL容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀釋至刻度，搖勻。（2）精密稱取10 mg葛根提取物A，將其轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，之后再精密量取0.50 mL溶液至于10 mL容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，以上步驟平行三次。對葛根提取物B做相同處理。（3）用紫外分光光度計(jì)掃描葛根素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的吸收曲線（濃度可隨機(jī)選?。?，確定最大吸收波長，然后采用定量測量的方式，測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）測定步驟（2）中葛根提取物A和B最終稀釋樣品的吸光度，取平均值，再對比標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得出相應(yīng)的濃度，最后分別計(jì)算兩種葛根提取物中總黃酮的含量。二、葛根提取物中葛根素的含量測定（1）精密量取0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至于10 mL容量瓶中，用10%的甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻。（2）精密稱取10 mg葛根提取物A，將其轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用10%的甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，對葛根提取物B做相同處理。（3）用高效液相色譜對配制的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，（4）用高效液相色譜對步驟（2）中葛根提取物A和B溶液進(jìn)行測定，對圖中的葛根素色譜峰進(jìn)行定性定量分析。六、結(jié)果與討論（1）葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光譜掃描曲線，說明檢測所需要的波長（2）葛根素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制（紫外），并以此工作曲線為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出葛根提取物A和B中的總黃酮含量（3）葛根提取物中葛根素含量的定性分析，即根據(jù)所得到的色譜圖，說明提取物A和B的色譜圖中那個(gè)峰代表的葛根素 （根據(jù)保留