sars病毒論文流感病毒論文：RNA分子抗SARS病毒的應用和研究進展.doc

sars病毒論文流感病毒論文：RNA分子抗SARS病毒的應用和研究進展嚴重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syn-drome, SARS)又稱傳染性非典型肺炎,是一種嚴重急性呼吸系統(tǒng)傳染病,系由SARS相關冠狀病毒(Severe acute re-spiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV)引起的新發(fā)傳染病1。SARS-CoV是單股正鏈RNA病毒,呈現(xiàn)典型冠狀病毒基因組結構特征:5-復制酶基因-S基因-E基因-M基因-N基因-3以及5和3端非編碼區(qū)2。SARS-CoV侵入宿主細胞后,首先以病毒基因組RNA為模板,翻譯自身RNA依賴的RNA聚合酶,然后利用這種聚合酶完成病毒負鏈亞基因組RNA轉錄、各結構蛋白的mRNA轉錄以及病毒基因組RNA復制等病毒粒增殖過程中的一系列環(huán)節(jié)3。目前SARS治療的主要策略有廣譜抗生素、抗病毒劑和免疫調制療法,但是很少的藥物能夠有效的對抗病毒4,因而對抗SARS治療而言,改進治療方案、開發(fā)更加特異性的藥物和更有效的療法十分重要?；诤怂岬幕蛘{控分子是長度約20個堿基的人工合成性單鏈或雙鏈DNA或RNA,這些分子包括核酸配體、反義寡核苷酸、核酶和小干擾性RNA,這些分子以序列特異性方式針對細胞或病毒的mRNA,造成靶mRNA斷裂和/或阻斷靶mRNA的轉錄與翻譯起始,因此成為基因功能分析和抗病毒藥物開發(fā)的有力工具。本文就這些不同類型RNA分子在抗SARS病毒的應用及機制研究的進展進行綜述。1RNA適配子在抗SARS-CoV中的應用適配子(aptamer)是能與多種目標分子以高親和力和高特異結合的核酸序列,從原始文庫中篩選與配體相對應的適配子的技術稱為指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進化技術,即SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrich-ment)5-7。用于抗病毒的適配子是以病毒基因表達調控有關的蛋白酶和關鍵基因作為主要靶點,如SARS-CoV的3CL蛋白酶和NTPase/解旋酶,還有雙鏈RNA/DNA解旋、RNA加帽活性中的關鍵基因均是理想的抗病毒靶點8。目前已經利用SELEX技術從多種文庫中篩選到能夠有效抑制解旋酶活性的適配子。Jang等9篩選出針對SARS-CoV的非結構蛋白nsP10的RNA適配子,可以有效抑制解旋酶的活性。然而,天然RNA在體內的穩(wěn)定性差,極易被體內各種RNA核酸酶降解,故難以在體內應用。Shum等10篩選到G-四倍體和非G-四倍體兩種構象的適配子。但是僅非G-四倍體能夠特異性地抑制病毒解旋酶活性,而G-四倍體卻不能。原因在于非G-四倍體經生物素或反向胸腺嘧啶修飾后在血清中的穩(wěn)定性增強,這種結構性選擇及對穩(wěn)定性的修飾作用為尋找解旋酶適配子提供了新線索。適配子具有靶分子范圍廣、親和力和特異性高、穩(wěn)定性好、制備方便等優(yōu)點。隨著對SARS-CoV感染復制機制的深入研究以及核酸適配體技術的發(fā)展,一些有效且低毒的適配體分子被篩選出來,為抗SARS治療帶來了希望,但是核酸適配子易被體內的核酸酶降解,因此它的修飾,轉移進細胞等方面也需要進一步研究。2反義RNA在抗SARS-CoV中的應用反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide, ASON)指能夠以堿基配對方式與特定DNA和RNA結合并阻止它們轉錄和翻譯的短核酸片段(反義鏈片段)。反義RNA與mR-NA的特異性互補結合可以抑制后者的翻譯。最早于大腸桿菌的產腸桿菌素的Col E1質粒中發(fā)現(xiàn)通過反義RNA控制mRNA翻譯,后來許多實驗證明在真核生物中也存在反義RNA11。就反義RNA抗病毒方面的研究而言,早在1978年就有報道表明反義寡核苷酸可以抑制勞氏肉瘤病毒的復制12。利用反義RNA能與特定的RNA病毒作用,直接抑制這些病毒的復制,從而阻斷RNA病毒的繁殖,達到抗病毒性疾病的目的。ASON在抑制SARS-CoV蛋白表達的實際應用中,主要通過化學修飾法來提高ASON的穩(wěn)定性,體外試驗證明硫代修飾的ASON能夠下調SARS-CoV結構蛋白E、M、N的表達量13。而3端修飾的ASON能夠抑制SARS-CoV突起蛋白(Spike Protein, SP)的mRNA的表達水平14。在抗病毒劑中廣泛研究的肽綴合反義嗎啉代寡聚體(Peptide-conjugated antisense morpholino oligomers, P-PMO)具有更強的反義作用,針對SARS-CoV 5UTR中轉錄調控序列合成的P-PMO可以減少病毒誘導的細胞病理學并減慢病毒在細胞間的擴散15。利用與SARS-CoV種系關系很近的鼠科肝炎病毒(MHV)在體內建立感染模型,顯示與MHV病毒基因組RNA5端配對的P-PMO可以減少病毒復制和小鼠組織損傷,但是這種P-PMO也具有潛在毒性16。Krahling等用磷酰二胺嗎啉修飾的PPMO可以抑制細胞凋亡17。而感染細胞的抗凋亡水平的升高能夠減少細胞的自殺現(xiàn)象18。反義核酸技術原理簡單、前景誘人,在基礎研究及抗病毒的研究中都顯示出很大的優(yōu)勢和潛力,在抗SARS的治療中也有潛在的應用價值,但在實際使用中還存在一些不容忽視的問題,如許多ASONs缺乏特異性且具有免疫刺激性和激活補體的毒副作用,這些都需要我們尋找更有效的途徑來改造和更新原有的思路,才能使它作為分子藥物不斷深入的研究。3核酶在抗SARS-CoV中的應用核酶是一類本身具有酶剪切活性的RNA,能夠以序列特異性方式催化靶RNA的切割。迄今發(fā)現(xiàn)的核酶從結構上主要分為兩大類:錘頭型核酶和發(fā)夾型核酶。核酶與反義RNA不同,它們具有催化活性,無免疫原性,在應用上可能比反義藥物具有更大的潛力,因此越來越廣泛地應用于基因研究與治療各領域。體內和體外實驗已經證明了核酶可以抑制HIV、HBV、HCV病毒的復制,近幾年也逐漸開始了動物水平的評價,已經批準核酶在抗HIV和癌癥方面進行臨床試驗19-21。Mizutani等報道了核酶與同源于SARS-CoV的病毒MHV的相互作用,其中與MHV基因組RNA的5端結合的核酶能夠抑制MHV增殖22。Maeda等合成了與MHV的RNA聚合酶特異結合的兩種錘頭型核酶:S-核酶和L-核酶,能夠使感染的子代病毒顆粒大量減少,盡管S-核酶剪切RNA的過程比L-核酶慢,但是這兩種核酶的作用效果是相同的23,24。然而,如何獲得高效、無毒的特異性核酶,如何選擇靶序列中最佳切割位點,如何提高核酶進入靶細胞的效率并穩(wěn)定發(fā)揮作用等問題對核酶今后的應用和發(fā)展提出了新的挑戰(zhàn)。因此,不斷采取新的設計策略,提高核酶的切割效率,通過人工篩選或修飾手段構建新的人工核酶并擴大核酶催化反應譜將成為核酶研究的主要內容之一。雖然核酶抗SARS-CoV的作用仍在研究中,至今還沒有明確結果,但是通過研究它對SARS-CoV種系很近的病毒的作用,可以推測核酶在抗SARS-CoV基因治療中的潛在效果,為預防和治療SARS又開拓了一條可行之路,很可能成為未來抗病毒研究的熱點。4siRNA在抗SARS-CoV中的應用RNAi(RNA interference, RNAi)最早在研究秀麗新小桿線蟲(Celegans)反義RNA的過程中發(fā)現(xiàn)25。在生物體內,雙鏈RNA被核糖核酸酶切割成長度21-23nt的小干擾性RNA(small interfering RNA, siRNA),它能與特定mR-NA結合引起其降解而導致基因沉默。有關報道顯示,siR-NA在細胞和動物水平均可以有效抑制病毒復制26,27。siRNA比ASON具有更強的優(yōu)勢和潛力,為研究抗SARS病毒感染過程提供了新的研究工具并且已成為當前的研究熱點之一。眾多研究者確定了針對SARS-CoV基因組的siRNA作用的不同靶位點,并在體外實驗和動物實驗中利用這些靶位點通過RNAi方法展示了高效的抗病毒作用。在體外細胞實驗中證實與SARS-CoV的S蛋白特異結合的siRNA能夠降低S蛋白的表達,并且在動物實驗中證明siRNA的作用能夠減輕發(fā)病癥狀28,29。目前廣泛應用化學合成和重組質粒法產生siRNA。以病毒RNA聚合酶基因為靶點的siR-NA重組表達質粒轉入細胞后能夠降低病毒RNA和病毒蛋白的表達水平,從而抑制病毒復制30。與SARS-CoV的非結構蛋白NSP1序列特異性結合的質粒表達型siRNA可以使感染后的細胞病變減輕、活細胞顯著增加、病毒空斑明顯減少31?；瘜W合成法因其合成效率更高,吸引了更多研究者的關注。由于對靶基因不同部位的siRNA具有不同的干擾效率,故需要對設計的siRNA進行篩選。Zheng32等從化學合成法產生的48條針對SARS-CoV基因組中各基因編碼區(qū)的siRNA篩選到4種有效抑制靶基因的分子,并且聯(lián)合應用可以顯著提高對靶基因表達的抑制效應。同樣,Shi等化學合成針對SARS-CoV中E、M和N蛋白基因的siRNA能使各個靶基因的表達水平降低80%33。Wu等合成的針對SARS-CoV前導序列、TRS、5-UTR和SP序列的siRNA能夠抑制SARS-CoV復制34。同時,體外實驗證實了針對SARS-CoV前導序列的siRNA的抑制強度高于針對S基因的siRNA和反義寡核苷酸35,這兩組結果說明前導序列可以作為有效靶點。盡管眾多研究以病毒基因組中的全長ORF作為研究SARS-CoV病毒復制的主要對象,但是實驗證明亞基因組RNAs(subgeomic RNA,sgRNA)對病毒的復制增殖也很重要。以SARS-CoV sgRNA設計的siR-NA能夠抑制病毒蛋白的表達,使子代病毒的增殖明顯減少36。在RNAi作用過程中,siRNA的穩(wěn)定性和特異性很重要。利用具有高親和力的核苷酸類似物-鎖定核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)修飾siRNA后,使其在血清中的穩(wěn)定性大大提高,并且對靶基因作用效率高于未修飾的siRNA37。siRNA逐漸成為抗病毒治療研究領域的熱門工具,為開發(fā)可以預防和治療SARS的潛在藥物創(chuàng)造了條件。在siRNA的應用過程中,怎樣設計出有效的siRNA序列,如何有效地將siRNA分子有效的轉移到靶器官并進入靶細胞,怎樣提高siRNA的穩(wěn)定性等問題還需解決。但是關于siRNA的許多研究結果使大家深信,siRNA是非常有希望被應用于臨床的。5結 語已知新型冠狀病毒SARS-CoV是引起嚴重急性呼吸道綜合征(SARS)的病原體,目前尚無有效的針對性預防和治療藥物。隨著分子生物學的進展,基因治療成為新的抗病毒策略。RNA相關的抗病毒策略能夠針對病毒基因組而對宿主的影響較小,因而在近期的抗SARA治療中得到廣泛關注,也取得了很大的進展。SARS-CoV基因組測序已經完成,對病毒的分子生物學特性有了一定了解,針對病毒復制、增殖相關的主要序列為靶點設計的RNA適配分子、反義核酸、核酶、siRNA能夠有效的抑制SARS-CoV的復制,現(xiàn)在成為醫(yī)學和生物學研究的前沿和熱點。本文主要闡述了RNA相關分子抗病毒機制取得的一些最新進展,國內外的科學家合成篩選出很多基于RNA的基因調控分子,體內體外實驗均有抗SARS病毒的作用。但是這些相關技術仍然需要克服核酸類化合物的固有限制性,如將合成的目的序列導入細胞的方法、在細胞內的穩(wěn)定性、如何避免脫靶現(xiàn)象和非特異性反應以及獲得高療效等。盡管還有很多工作要做,但是這些RNA相關生物技術的研究結果已經顯示了誘人的前景,為研究抗SARS病毒藥物提供了可行性,具有廣闊的應用前景和臨床實用價值。參考文獻:1 Marra M A, Jones S J, Astell C R, et alThe genomesequence of the SARS associated coronavirusJ. Sci-ence, 2003, 300(5624): 1399-1404.2 Paul A, Rota M, Steven O, Stephan S, et al. Charac-terization of a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory SyndromeJ. Science, 2003, 300(5624): 1394-1399.3芮偉,張其鵬,石磊,等. SARS冠狀病毒RNA聚合酶編碼區(qū)分析.北京大學學報(醫(yī)學版) (Rui W, Zhang QP, Shi L, et al. Analysis of coding region in RNA poly-merase of SARS-CoVJ. Peking Univ (Heal Sci),2003, 35: 137-138.4 Stockman L J, Bellamy R, Garner P. SARS: systematicreview of treatment effectsJ. PLoS Med, 2006, 3(9),e3435 Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by ex-ponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymeraseJ. Science, 1990, 249: 505-510.6 Ellington A D, Szostak J W.In vitroselection of RNAmolecules that bind specific ligandsJ. Nature, 1990,346: 818-822.7 Jayasena S D. Aptamers: an emerging class of moleculesthat rival antibodies in diagnostics J. Clin Chem,1999, 45: 1628-1650.8 Thiel V, Ivanov K A, Putics A, et al. Mechanisms andenzymes involved in SARS coronavirus genome expres-sionJ. J Gen Virol, 2003, 84(9): 2305-2315.9 Jang K J, Lee N R, Yeo W S, et al. Isolation of inhibi-tory RNA aptamers against severe acute respiratory syn-drome (SARS) coronavirus NTPase/HelicaseJ. Bio-chem Biophys Res Commun, 2008, 366(3):738-744.10 Shum K T, Tanner J A. Differential inhibitory activi-ties and stabilisation of DNA aptamers against theSARS coronavirus helicaseJ. Chembiochem, 2008, 9(18): 3037-3045.11 Tomizawa J, Itoh T, Selzer G, et al. Inhibition ofColE1 RNA primer formation by a plasmid-specifiedsmall RNAJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981, 78(3): 1421-1425.12 Zamecnik P C, Stephenson M L. Inhibition of Roussarcoma virus replication and cell transformation by aspecific oligodeoxynucleotideJ. Proc Natl Acad SciUSA, 1978, 75(1): 280-284. 13 Shi Y, Luo H, Jia J, et al. Antisense downregulationof SARS-CoV gene expression in Vero E6 cellsJ. JGene Med, 2005, 7(1): 97-10714 Wang Z, Shi J, Jin H, et al. Properties of isonucleoti-de-incorporated oligodeoxynucleotides and inhibition ofthe expression of spike protein of SARS-CoVJ. Bio-conjug Chem, 2005, 16(5):1081-1087.15 Neuman B W, Stein D A, Kroeker A D, et al. Inhibi-tion, escape, and attenuated growth of severe acute re-spiratory syndrome coronavirus treated with antisensemorpholino oligomers J. J Virol, 2005, 79 (15):9665-9676.16 Neuman B W, Stein D A, Kroeker A D, et al. Inhibi-tion and escape of SARS-CoV treated with antisensemorpholino oligomersJ. Adv Exp Med Biol, 2006,581: 567-571.17 Krahling V, Stein D A, Spiegel M, et al. Severe acuterespiratory syndrome coronavirus triggers apoptosis viaprotein kinase R but is resistant to its antiviral activityJ. J Virol, 2009, 83(5): 2298-2309.18 Parris G E. Hypothesis links emergence of chloro-quine-resistant malaria and other intracellular patho-gens and suggests a new strategy for treatment of dis-eases caused by intracellular parasitesJ. Med Hypot-heses, 2004, 62(3): 354-35719 Alessio P. Prospects for antiviral ribozymes and de-oxyribozymesJ. Rev. Med, Virol, 2004, 14: 47-64.20 Jon E. Chatterton, Hu X Y, et al. Ribozymes in geneidentification, target validation and drug discoveryJ.Targets, 2004, 3(1): 10-17.21 Khan A U. Ribozyme: A clinical toolJ. ClinicaChimica Acta, 2006, 367: 20-27.22 Mizutani T, Hayashi M, Maeda A, et al. Inhibition ofmouse hepatitis virus multiplication by antisense oligo-nucleotide, antisense RNA, sense RNA and ribozymeJ. Adv Exp Med Biol, 1993, 342: 129-135.23 Maeda A, Mizutani T, Hayashi M, et al. Inhibition ofviral multiplication by hammerhead ribozymes targetedagainst the polymerase gene of mouse hepatitis virusJ. J Vet Med Sci, 1994, 56(5): 939-945.24 Maeda A, Mizutani T, Hayashi M, et al. Inhibition ofviral multiplication in acute and chronic stages of infec-tion by ribozymes targeted against the polymerase geneof mouse hepatitis virusJ. Adv Exp Med Biol, 1995,380: 399-404.25 Wilkins C, Dishongh R, Moore S C, et al. RNA inter-ference is an antiviral defence mechanism in Caenorhab-ditis elegans. Nature, 2005, 436(7053): 1044-1047.26 Park W S, Miyano-Kurosaki N, Hayafune M, et al.Prevention of HIV-1 infection in human peripheralblood mononuclear cells by specific RNA interference. NucleicAcids Res, 2002, 30(22): 4830-4835.27 McCaffrey A P, Nakai H, Pandey K,et al. Inhibitionof hepatitis B virus in mice by RNA interference. NatBiotechnol, 2003, 21(6): 639-644.28 Zhang Y, Li T, Fu L, et al. Silencing SARS-CoVSpike protein expression in cultured cells by RNA in-terferenceJ. FEBS Lett. 2004, 560(1-3): 141-146.29 Li B J, Tang Q, Cheng D, et al. Using siRNA inprophylactic and therapeutic regimens against SARScoronavirus in Rhesus macaqueJ. Nat Med, 2005,11(9): 944-951.30 Wang Z, Ren L, Zhao X, et al. Inhibition of severe a-cute respiratory syndrome virus replication by small in-terfering RNAs in mammalian cellsJ. J Virol, 2004,78(14): 7523-7527.31 Ni B, Shi X, Li Y, et al. Inhibition of replication andinfection of severe acute respiratory syndrome-associat-ed coronavirus with plasmid-mediated interferenceRNAJ. Antivir Ther, 2005, 10(4): 527-533.32 Zheng B J, Guan Y, Tang Q, et al. Prophylactic andtherapeutic effects of small interfering RNA targetingSARS-coronavirusJ. Antivir Ther, 2004, 9(3): 365-374.33 Shi Y, Yang D H, Xiong J, et al. Inhibition of genesexpression of SARS coronavirus by synthetic small in-terfering RNAsJ. Cell Res, 2005, 15(3): 193-200.34 Wu C J, Huang H W, Liu C Y, et al. Inhibition ofSARS-CoV replication by siRNAJ. Antiviral Res,2005, 65(1): 45