植物細胞工程的原理、方法和應(yīng)用.docx

植物細胞工程原理、方法和應(yīng)用一植物細胞工程的原理及方法 植物細胞具有全能性，即具有某種生物全部遺傳信息的任何一個細胞，都具有發(fā)育成完整生物體的潛能。而讓細胞發(fā)揮出全能性的方法，就是細胞脫分化。細胞脫分化，就是讓已經(jīng)分化的細胞，經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成為未分化細胞，進而形成愈傷組織。愈傷組織在一定的培養(yǎng)條件下，分化出幼根和芽，進而形成完整小植株，這就是愈傷組織再分化。歸結(jié)起來，植物細胞工程的主要原理是植物細胞的全能性，以及單倍體育種、植物的低溫儲藏等?，F(xiàn)在我們就來著重談一談植物細胞全能性，一個植物體的全部細胞，都是從受精卵經(jīng)過有絲分裂產(chǎn)生的。受精卵是一個特異性的細胞，它具有本種植物所特有的全部遺傳信息。因此，植物體內(nèi)的每一個體細胞也都具有和受精卵完全一樣的DNA序鏈和相同的細胞質(zhì)環(huán)境。當這些細胞在植物體內(nèi)的時候，由于受到所在器官和組織環(huán)境的束縛，僅僅表現(xiàn)一定的形態(tài)和局部的功能?？墒撬鼈兊倪z傳潛力并沒有喪失，全部遺傳信息仍然被保持在DNA的序鏈之中，一旦脫離了原來器官組織的束縛，成為游離狀態(tài)，在一定的營養(yǎng)條件和植物激素的誘導(dǎo)下，細胞的全能性就能表現(xiàn)出來。于是就象一個受精卵那樣，由單個細胞形成愈傷組織然后成為胚狀體，再進而長成一棵完整的植株。所以離體培養(yǎng)之所以能夠成功，首先是由于植物細胞具有全能性的緣故。一.植物組織培養(yǎng)技術(shù) 植物的組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在無菌條件下接種在含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。狹義是指組培指用植物各部分組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。 其中，培養(yǎng)技術(shù)又分為：胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。1、胚胎培養(yǎng)：指以從胚珠中分離出來的成熟或未成熟胚為外植體的離體無菌培養(yǎng)。植物胚胎培養(yǎng)又分為1胚培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、植物離體受精，是對不同的胚進行人工離體無菌培養(yǎng)。意義：1,克服雜種胚的敗育,獲得稀有雜種2,獲得單倍體和多倍體植株3,打破種子休眠,促進胚萌發(fā)4,快速繁殖良種,縮短育種周期5,克服種子生活力低下和自然不育性,提高種子發(fā)芽率6,提高后代抗性,改良品質(zhì)7,種子活力的快速測定8,種質(zhì)資源的搜集和保存9,研究胚胎發(fā)育的過程和控制機制2.組織培養(yǎng)指以分離出植物各部位的組織（如分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮、皮層、胚乳組織、薄壁組織、髓部等），或已誘導(dǎo)的愈傷組織為外植體的離體無菌培養(yǎng)。這是狹義的植物組織培養(yǎng)。方法：1、非試管微組織快繁非試管微組織快繁技術(shù)是將外植體（一般要求帶一葉一芽）放置在室內(nèi)外普通沙子培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，利用植物腋芽自然倍增達到快速繁殖的目的。一般植物715天可以生長出根系。此技術(shù)投資低，操作環(huán)節(jié)少。2、試管組織培養(yǎng)試管組織培養(yǎng)是將外植體（即離體組織、器官或細胞）放置在組培瓶等器皿中在無菌的條件下進行組織培養(yǎng)獲得組培瓶苗。優(yōu)點：1、占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限制。2、培養(yǎng)脫毒作物3、培養(yǎng)周期短4、可用組培中的愈傷組織制取特殊的生化制品5、可短時間大量繁殖，用于拯救瀕危植物6、可誘導(dǎo)之分化成需要的器官，如根和芽7、解決有些植物產(chǎn)種子少或無的難題，8、不存在變異，可保持原母本的一切遺傳特征9、投資少，經(jīng)濟效益高10、繁殖方式多，試用品種多3、器官培養(yǎng)指以植物的根、莖、葉、花、果等器官為外植體的離體無菌培養(yǎng)，如根的根尖和切段，莖的莖尖、莖節(jié)和切段，葉的葉原基、葉片、葉柄、葉鞘和子葉，花器的花瓣、雄蕊（花藥、花絲）、胚珠、子房、果實等的離體無菌培養(yǎng)。一般與組織培養(yǎng)沒有大的差別，但對含有葉綠素的器官，要在光下進行單獨營養(yǎng)，因此能在簡單的只含無機鹽的培養(yǎng)基中即可發(fā)育。但是在暗培養(yǎng)條件下，如果不供給呼吸基質(zhì)和維生素類以及其它有機物則不能生長。植物的培養(yǎng)組織，比動物器官的形成能力要大得多。許多組織培養(yǎng)，培養(yǎng)時間長了，便過渡到器官培養(yǎng)，因此這里不易嚴格區(qū)分，可把兩者總括起來稱為廣義的組織培養(yǎng)。4、單細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)是在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行震蕩培養(yǎng)，得到分散成游離 的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。依據(jù)的原理是植物細胞的全能性。而植物單細胞培養(yǎng)則在此基礎(chǔ)上，提供了進一步篩選的可能性。因為在植物的體細胞中，并不是每個細胞的生命狀態(tài)以及活性都是相同的。我們可以選出具有優(yōu)良性狀的體細胞進行單細胞培養(yǎng)，獲得更佳的植株。5、原生質(zhì)體培養(yǎng)。指以除去細胞壁的原生質(zhì)體為外植體的離體無菌培養(yǎng)。主要有液體淺層培養(yǎng)法、液體懸滴培養(yǎng)、固體平板法、固液雙層培養(yǎng)法（應(yīng)用最廣泛）、瓊脂糖珠培養(yǎng)法。特征：無細胞壁障礙，可以方便地進行有關(guān)遺傳操作，并可以對膜，細胞器等進行基礎(chǔ)研究。具有全能性，并能進行人工培養(yǎng)發(fā)育成完整植株。原生質(zhì)體適合進行誘導(dǎo)融合形成雜種細胞。意義：植物原生質(zhì)體是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源；植物原生質(zhì)體是細胞融合工作的基礎(chǔ)；植物原生質(zhì)體是植物遺傳工程的理想受體和遺傳飾變的理想材料；在細胞生物學(xué)與遺傳理論研究上的應(yīng)用。二人工誘發(fā)單倍體單倍體育種，同樣是基于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)（如花藥離體培養(yǎng)等）誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，再通過某種手段使染色體組加倍（如用秋水仙素處理），從而使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)。單倍體是具有體細胞染色體數(shù)為本物種配子染色體數(shù)的生物個體。方法：花藥離體培養(yǎng)；秋水仙素處理使染色體加倍意義：單倍體植株經(jīng)染色體加倍后，在一個世代中即可出現(xiàn)純合的二倍體(一般情況下為純合，但在親本為多倍體情況下，得到的單倍體植株加倍后，子代可能為雜合。)1，從中選出的優(yōu)良純合系后代不分離，表現(xiàn)整齊一致,可縮短育種年限。單倍體植株中由隱性基因控制的性狀，雖經(jīng)染色體加倍,但由于沒有顯性基因的掩蓋而容易顯現(xiàn)。這對誘變育種和突變遺傳研究很有好處。在誘導(dǎo)頻率較高時，單倍體能在植株上較充分地顯現(xiàn)重組的配子類型，可提供新的遺傳資源和選擇材料。中國首先應(yīng)用單倍體育種法改良作物品種，已育成了一些煙草、水稻、小麥等優(yōu)良品種。單倍體育種如能進一步提高誘導(dǎo)頻率并與雜交育種、誘變育種、遠緣雜交等相結(jié)合應(yīng)用，則在作物品種改良上的作用將更顯著。三細胞融合植物細胞融合是指人工的方法用纖維酶、果膠酶等酶作用于植物組織，并將獲得的原生質(zhì)體通過聚乙二醇等誘導(dǎo)融合劑使相鄰原生質(zhì)體融合在一起。然后, 經(jīng)過原生質(zhì)體培養(yǎng)、細胞壁再生、愈傷組織形成, 最后培育成再生植物。同種細胞在培養(yǎng)時2個靠在一起的細胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；異種間的細胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合，稱誘發(fā)融合。優(yōu)點：細胞融合不僅可用于基礎(chǔ)研究，而且還有重要的應(yīng)用價值，在植物育種方面已經(jīng)成功的有蘿卜+甘藍、粉藍煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。細胞融合另一個重要應(yīng)用就是制備單克隆抗體。單克隆抗體可以用作診斷試劑，治療疾病和運載藥物，具有準確，高效，簡易，快速等優(yōu)點。四超低溫冷凍保存種子超低溫冷凍保存種子，是將植物的細胞或組織經(jīng)過防凍處理后，在-80C以下保存的方法。原理： 極端低溫溫度下，活細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止。因此，細胞、組織和器官在超低溫保存過程中不會引起遺傳性狀的改變，也不會丟失形態(tài)發(fā)生的潛能。同時，由于超低溫條件下，生物的代謝和衰老過程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長期保存植物材料。意義：1.防止資源滅絕、節(jié)約人力物力、便于交流。2.可以在有限空間內(nèi)保存大量資源。3.與種子保存相比，可以不受時間和高含水量的限制。4.與試管苗相比，可以避免頻繁繼代而帶來的變異。貳植物細胞工程的應(yīng)用一、胚胎培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用植物胚胎培養(yǎng)是胚、胚珠、子房和胚乳的離體培養(yǎng)技術(shù), 其應(yīng)用領(lǐng)域包括胚胎的發(fā)育機理、克服雜交不親合性和胚拯救、克服珠心胚的干擾、打破種子休眠, 縮短育種周期, 獲得體細胞胚和人工種子, 建立植物高效再生體系等, 并在農(nóng)作物、園藝作物、林木和藥用植物上廣泛應(yīng)用。植物離體受精可通過離體柱頭授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉、離體精細胞和卵細胞融合等方法實現(xiàn)。該技術(shù)可以克服植物授粉不親和的問題, 同時也可以進行胚胎、種子和果實發(fā)育機理等基礎(chǔ)研究。人工分離的精細胞和卵細胞融合后進行合子胚培養(yǎng), 已在玉米等植物上獲得成功 13 。植物離體受精技術(shù)是植物細胞工程中的重要實驗技術(shù), 為研究植物胚胎發(fā)育機理提供了新的實驗系統(tǒng), 為開發(fā)新的植物轉(zhuǎn)基因途徑提供了可能二、微型繁殖即使用于快速繁殖優(yōu)良品種的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，也叫快速繁殖技術(shù)。該技術(shù)可以保持優(yōu)良品種的遺傳特性，且具有周期短，不受季節(jié)、氣候、自然災(zāi)害等因素影響等優(yōu)點。以此它能夠快速的實現(xiàn)種苗的大量繁殖。三、人工種子農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種皮、胚乳和胚三部分構(gòu)成。種皮通常在種子的外層起保護作用；胚乳含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，是種苗萌發(fā)生長不可缺少的營養(yǎng)來源；胚由胚芽、胚軸、胚根和子葉構(gòu)成，將來發(fā)成植株。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，可把植物組織的細胞培養(yǎng)成在形態(tài)及生理上與天然種子胚相似的胚狀體，也叫作體細胞胚。這種體細胞胚有于葉、根、莖分生組織的結(jié)構(gòu)。科學(xué)家把體細胞胚包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具備種子機能。所以，人工種子是一種人工制造的代替天然種子的顆粒體，可以直接播種于田間。意義：1.在無性繁殖植物中，有可能建立一種高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品種的種性，又可以使之具有實生苗的復(fù)壯效應(yīng)；2.可以對優(yōu)異雜種不通過有性制種而快速獲得大量種子，特別是對于那些制種困難的植物更具有主要的適用意義；3.對于一些不能正常產(chǎn)生種子的特殊植物材料如三倍體、非整倍體、工程植物等，有可能通過人工種子在短期內(nèi)加大繁殖應(yīng)用；4.與田間制種相比，可以節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，同時還避免了種子攜帶病原菌的危險；5.與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實現(xiàn)機械化操作，同時還便于儲藏和運輸。四、作物脫毒就植物脫毒而言，基本分為有性脫毒，無性脫毒兩種。有性脫毒就是種子。無性脫毒，一般為組織培養(yǎng)。一般來說，為了改善植物的性狀，長期的無性繁殖再植物細胞內(nèi)積累了大量的有毒物質(zhì)，從而對植物的壽命，性狀，產(chǎn)量等產(chǎn)生一定的影響。往往植物還容易的一些病害。所以，無性生殖的植物，需要經(jīng)常脫毒。以加強植物的性狀，防治一些病害通常利用組織培養(yǎng)，去植物的莖尖部分進行細胞培養(yǎng)，用培養(yǎng)出的病毒濃度較低的植株，在去其莖尖，進一步培養(yǎng)。這樣反復(fù)幾次之后，病毒的濃度逐漸降低，最后得到基本無毒的植物。五、突變體的利用即使對植物組織培養(yǎng)過程中的愈傷組織進行誘變處理，初期發(fā)生突變，誘導(dǎo)分化成植株，篩選對人們有利的突變體，進而培育新品種。六加倍單倍體技術(shù)及其應(yīng)用加倍單倍體技術(shù)是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)單倍體植物材料 獲得單倍體植物, 然后通過自然或人工加倍的方法獲得雙倍體植株的技術(shù), 其中以花藥和花粉培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛。 雌核發(fā)育( Gynogenesis) 是植物存在的自然現(xiàn)象,在離體條件下可以通過培養(yǎng)未受精的子房和胚珠產(chǎn)生單倍體植株, 也可以在活體條件下通過授以不同種類的花粉或通過物理方法處理( 如輻照處理) 的花粉, 誘導(dǎo)雌核發(fā)育 15 , 目前已在小麥、水稻、玉米、甜菜、向日葵、馬鈴薯、西葫蘆、洋蔥、黃瓜、非洲菊、百合、小黑楊、三葉橡膠、煙草、矮牽牛等10 多種植物上獲得成功。離體條件下誘導(dǎo)孤雌生殖獲得加倍單倍體的技術(shù)發(fā)展時間不長, 現(xiàn)已開始應(yīng)用于作物的改良、構(gòu)建遺傳分析和轉(zhuǎn)基因的受體材料?！?】 韓佳寅； 梁愛華。全胚胎培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用研究進展。中國中藥雜志。2010（05）【2】 李杰;黃敏仁;王明庥;蔡汝。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合的研究進展。海南師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)。2005-09-30【3】 陳欽耀。植物細胞融合技術(shù)的研究概況。生物學(xué)雜志。1984（03）【4】 汪勛清； 劉錄祥。植物細胞工程研究應(yīng)用與展望。核農(nóng)學(xué)報.2008（05）【5】 陳慶華。突變體的選擇和利用(二)。遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)。1982（05）【6】 丁紹歡； 張明生； 史夢娜。植物人工種子技術(shù)研究進展。種子, Seed。2011（03）7霍乃蕊； 韓克光。細胞融合技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用、激光生物學(xué)報。2006（02）8 劉巧泉；周麗慧；王紅梅；顧銘洪. 水稻種子貯藏蛋白合成的分子生物學(xué)研究進展分子植物育種.2008(01)【9】張圣倉；魏安智；楊途熙. 果樹單倍體和加倍單倍體(DH)技術(shù)研究與應(yīng)用進展. 果樹學(xué)報.2011(05)10 黃靜；趙琦；趙玉錦等. 植物細胞電融合技術(shù)在空間實驗中的應(yīng)用. 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STUDY ON WAYS OF FORCING INTERCELLULAR CYTOPLASM AND CHROMATIN MIGRATION TO TRANSFER EXTERNAL GENETIC SUB