MTT原理方法及操作步驟.doc

MTT原理、步驟、結果分析方法及注意事項MTT原理MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。 需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。MTT一般最好現用現配，過濾后4C避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g調pH 7.4,定容1L。普通MTT法實驗步驟：1：接種細胞：用含10胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.2: 培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。4：比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。藥物MTT法實驗步驟貼壁細胞：1: 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000- 10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2: 5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況3: 5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5: 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7: 同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。懸浮細胞：1: 收集對數期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度1106/ml，按次序將補足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細胞懸液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）2: 置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5、同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。注意事項：(1) 選擇適當得細胞接種濃度。(2) 避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養(yǎng)液。(3) 設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。(4) MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系。(5) 用96孔板培養(yǎng)細胞做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適根據書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定(6) 一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。轉MTT法原理、步驟以及注意事項MTT原理MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處（也有用570nm波長的，我目前用的都是570nm)測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。MTT一般最好現用現配，過濾后4避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。我自己操作一般是每次配制15ml,過濾后4避光保存，在兩周內用完。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g調pH 7.4,定容1L。普通MTT法實驗步驟：1：接種細胞：用含10胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.2: 培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，脫色搖床振蕩10min，使結晶物充分融解。4：比色：選擇490nm（570nm）波長，在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。藥物MTT法實驗步驟貼壁細胞：（我的主要操作是貼壁細胞）1: 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000- 10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2: 5%CO2，37孵育，至細胞貼壁，加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況。3: 5%CO2，37孵育24-72小時，倒置顯微鏡下觀察。4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5: 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm（570nm)處測量各孔的吸光值。7: 同時設置調零孔即空白組（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。懸浮細胞：1: 收集對數期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度1106/ml，按次序將補足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細胞懸液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）。2: 置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5、同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。注意事項：(1) 選擇適當得細胞接種濃度。每孔1000-10000個，但是也要看細胞種類和狀態(tài)。我做的是藥物抑制腫瘤細胞生長和增殖，鋪過2000至8000個每孔。2000太低，8000過高，對于陰性組高于5000個吸光值就很大，大于1.5。所以對于我自己的A549實驗一般選用3000-5000。一般每孔4000個細胞為宜(2) 避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養(yǎng)液。(3) 設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。(4) MTT實驗吸光度最后要在0