實(shí)驗(yàn)三、小鼠骨髓染色體制備與觀察.ppt

實(shí)驗(yàn)三 小鼠骨髓染色體標(biāo)本的制備及觀察 李孝敬基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)樓A412生科院辦公室電話一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?初步掌握 小鼠 骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備原理和方法鞏固顯微鏡的操作技術(shù)了解小鼠的染色體形態(tài)特征 二 實(shí)驗(yàn)原理 染色體是組成細(xì)胞核的基本物質(zhì) 是基因的載體 染色體異常也稱染色體發(fā)育不全 目前已確認(rèn)染色體病綜合征100余種 智力低下和生長發(fā)育遲滯是染色體病的共同特征 21三體綜合征 18三體綜合征 貓叫綜合征 18三體綜合征 二 實(shí)驗(yàn)原理 染色體標(biāo)本的觀察廣泛應(yīng)用于一些疾病的臨床診斷中 例如白血病 惡性血液病等的診斷 染色體是染色質(zhì)在細(xì)胞分裂期的存在形式 細(xì)胞分裂的中期 染色體在赤道板上排列清晰 是染色體觀察的最佳時(shí)期 骨髓細(xì)胞數(shù)量多且分裂旺盛 可直接進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備 取材方便 操作簡單和無需無菌培養(yǎng) 是研究小型哺乳動物等染色體的常用方法 人骨髓染色體抽取 怎樣才能制備一個(gè)好的染色體標(biāo)本 獲得大量處于有絲分裂中期的細(xì)胞 使細(xì)胞膜破裂 且染色體能夠完整并較分散的釋放出來 秋水仙素處理 秋水仙素溶液可抑制紡錘體的形成 使正在分裂的骨髓細(xì)胞停止在細(xì)胞分裂中期 積累大量中期分裂相細(xì)胞 低滲作用 使細(xì)胞充分膨脹 減少染色體間的相互纏繞和重疊 預(yù)固定 終止低滲作用 使細(xì)胞離心時(shí)不易破裂 固定維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 高距離滴片 使細(xì)胞膜易于破裂 獲得中期染色體標(biāo)本 在顯微鏡下觀察染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量 三 實(shí)驗(yàn)器材和試劑 1 器材蠟盤 手術(shù)剪 小鑷子 平皿 注射器 10ml離心管 吸管 量筒 預(yù)冷載玻片 試管架 離心機(jī) 恒溫水浴鍋 顯微鏡 乙醚酒精 擦鏡紙2 試劑100ug秋水仙素液 0 075mol LKCl低滲液 Giemsa染液 1 秋水仙素處理 選擇體重20g左右的小白鼠 按2 4ug g 小鼠 秋水仙素 與處死前4h 對其進(jìn)行腹腔注射100ug mL秋水仙素液 四 實(shí)驗(yàn)步驟 注意 剪去少量骨質(zhì) 避免骨髓細(xì)胞丟失 擦凈血跡和肌肉細(xì)胞以免影響觀察 用0 075mol LKCl收集足量細(xì)胞 反復(fù)沖洗直到股骨發(fā)白 2 取材 頸椎脫臼法處死取兩后肢股骨紗布擦凈肌肉剪去股骨兩頭 暴露骨髓腔低滲液 5ml 沖洗至離心管內(nèi)收集骨髓細(xì)胞 頸椎脫臼法處死小鼠 3 低滲 用吸管吹打骨髓細(xì)胞使其分散 加入預(yù)溫37 的低滲液至8ml 將離心管至37 水浴鍋中 保溫至少30min后取出 使細(xì)胞充分吸水膨脹 低滲不足 則細(xì)胞膨脹不夠 滴片時(shí)細(xì)胞不破裂 低滲過度 則細(xì)胞提前破裂 染色體觀察不全 空氣吹打法 用吸管橡膠頭內(nèi)的空氣混勻液體 4 預(yù)固定 加1ml新配制固定液混勻1500r min 5min棄上清液 固定液 甲醇 冰乙酸 3 1 需現(xiàn)配 離心需要配平 作用 終止低滲 維持細(xì)胞的膨脹狀態(tài) 防止離心破裂 5 固定 制細(xì)胞懸液 加固定液5ml吹打混勻固定15min離心1500r min 5min棄上清 加固定液0 2 0 4ml吹打成細(xì)胞懸液 準(zhǔn)備制片使用 制備細(xì)胞懸液時(shí) 根據(jù)具體情況加固定液 以懸液呈現(xiàn)乳白色為宜 6 滴片 冰片傾斜30 細(xì)胞懸液距離玻片30cm高 在不重疊位置滴1 2滴 用口吹散細(xì)胞 過火焰干燥 注意 載玻片預(yù)冷 高度 吹散 不可使載玻片燙手 7 染色 在玻片上滴幾滴Giemsa染液并鋪勻 8 10min 倒去染液 晾干 染色盤中進(jìn)行 8 小鼠染色體觀察 低倍鏡 高倍鏡下尋找染色體分散的中期分裂相 小鼠骨髓染色體10 10 小鼠骨髓染色體10 40 數(shù)目觀察 小鼠2倍體細(xì)胞染色體 數(shù)目2n 40條 其中19對為常染色體 一對為性染色體 染色體的核型分為4組 雄性XY 雌性XX Y染色體最小 形態(tài)特征觀察 端著絲粒染色體 U V 五 注意事項(xiàng) 1 掌握好秋水仙素的濃度和處理時(shí)間 2 離心前需要配平 3 小鼠骨髓要沖洗干凈 以收集足夠的骨髓細(xì)胞 3 低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵 注意低滲時(shí)間 4 固定液要現(xiàn)配現(xiàn)用 固定要充分 5 載玻片要潔凈并預(yù)冷 滴片要有一定的高度 6 細(xì)胞懸液不能太稀 要呈乳白色 7 烤片