基因工程藥物研發(fā)的基本過(guò)程(doc 22頁(yè)).doc

基因工程藥物研發(fā)的基本過(guò)程基因工程藥物的研發(fā)分為上游和下游兩個(gè)階段：上游階段：主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌(細(xì)胞)。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達(dá)。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)的量和分離純化的難易。 此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開(kāi)發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等。血管抑制素(angiostatin ,簡(jiǎn)稱AGN) 是纖溶酶原的一個(gè)酶解片段,相當(dāng)于其14 Kringle 區(qū),具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制血管生成及抑制多種類型腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的生物功能,是一種新型血管生成抑制因子1 , 2 ,對(duì)于控制腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、消化道潰瘍、關(guān)節(jié)炎等病理性血管生成具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景.PCR產(chǎn)物的T載體克?。ㄒ唬?重組T質(zhì)粒的構(gòu)建一原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。因?yàn)镈NA片斷有兩個(gè)端點(diǎn)，所以切割時(shí)出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對(duì)于單酶切來(lái)說(shuō)，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導(dǎo)致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對(duì)載體進(jìn)行5除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3OH末端與5端，所以除磷后載體不會(huì)自環(huán)。一旦有外源片斷插入時(shí)，由外源片斷提供5端就能與載體進(jìn)行連接。通過(guò)這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。對(duì)于雙酶切來(lái)說(shuō)，無(wú)論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個(gè)特點(diǎn)是能將供體分子定向連接到載體上。連接反應(yīng)的溫度在37時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16，連接12-16h（過(guò)夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。二材料與方法1 材料外源DNA片斷2 儀器、用具移液槍、碎冰3 試劑pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法連接體系如下：16連接過(guò)夜。（二） 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定1 材料E.coli JM109菌株2 儀器、用具超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、1.5ml 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器3 試劑(1) CaCl2、LB平板（見(jiàn)附錄）；SOC培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄）；SOB培養(yǎng)基(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；無(wú)水乙醇的Buffer W2a(3) 1電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）有毒，小心；瓊脂糖；6加樣緩沖液(4) 酚；氯仿；異戊醇(5) ddH2O；10PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1) 取大腸桿菌JM109保存液50l，接種于4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37，300rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，第二天取50l 轉(zhuǎn)接到新的4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3h至OD600=0.350.4，在無(wú)菌操作臺(tái)上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。(2) 4，5000rpm離心2min，去上清液。(3) 加入750l預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰浴30min。(4) 4，5000rpm離心2min，棄上清液。(5) 加入100l 冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4保存?zhèn)溆谩?. 重組DNA的轉(zhuǎn)化(1) 將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37預(yù)熱。(2) 于100l感受態(tài)細(xì)胞中加入10l連接產(chǎn)物，冰浴30min。(3) 將離心管轉(zhuǎn)入42水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動(dòng)離心管，迅速將其放在冰上2min。(4) 在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300l，槍頭混勻，37、150rpm溫和搖振60min。(5) 將200l 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑選白色菌落進(jìn)行鑒定。注意事項(xiàng)： 制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作，同時(shí)注意近火無(wú)菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。 42熱處理時(shí)很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。 菌液涂皿操作時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來(lái)回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。3 重組質(zhì)粒的鑒定方案一 菌落PCR(1) 制備PCR混合液：(2) 用經(jīng)滅菌的10l槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3) 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。(4) 將步驟 的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5) 按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94預(yù)變性3min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94變性1min，57退火1min，72 延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min。(6) 取5l PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。方案二 質(zhì)粒PCR1. 堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA(1) 用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。(2) 用250l已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。(3) 加入250l Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，此步驟不宜超過(guò)5min。*Buffer S2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。(4) 加入400l Buffer S3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。*若離心后凝結(jié)塊未沉淀到離心管底部，應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，12000g離心3min。(5) 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm離心1min。(6) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500l Buffer W1，5500rpm離心1min。(7) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700l已加無(wú)水乙醇的Buffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700l已加無(wú)水乙醇的BufferW2洗滌一次。(8) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm離心1min。(9) 連濾液一并棄掉收集管，將DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 離心管中，在silica 膜中央加入25-30l Eluent或去離子水。(10) 室溫靜置2 min，14000rpm離心1min洗脫DNA。(11) 取5L樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉(zhuǎn)化子。2. 抽提純化質(zhì)粒DNA酚、氯仿抽提可以去除堿裂解法制備的質(zhì)粒DNA中殘留的蛋白質(zhì)。(1) 加TE稀釋質(zhì)粒DNA溶液至300L。(2) 加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），震蕩混勻，靜置3min。(3) 14000rpm 離心5min，吸上清液，加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3min。(4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，靜置3min。(5) 14000rpm離心5min，吸上清液，加2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后-20放置15min，沉淀質(zhì)粒DNA。(6) 14000rpm離心13min，棄上清液，沉淀加入200L 70%乙醇洗滌一次，室溫干燥，用20L去離子雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA沉淀，-20保存待用。(7) 取5l樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化結(jié)果。3. 質(zhì)粒PCR(1) PCR反應(yīng)體系如下：(2) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94預(yù)變性3min；然后進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94變性1min，57退火1min，72 延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min。(3) 取5l PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，方法與試驗(yàn)二相同。PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，平滑末端連接和粘性末端連接，平滑末端比粘性末端的連接效率要低很多。平滑末端連接：載體為平末端，可用 EcoR V或Sma I酶切，同時(shí)為了防止載體自連，對(duì)載體做了去磷酸處理。PCR產(chǎn)物為磷酸化的平末端產(chǎn)物：一般高保真聚合酶擴(kuò)增得到，高保真聚合酶有很強(qiáng)的35外切酶活性?；?qū)⒎瞧侥┒说腜CR產(chǎn)物使用DNA聚合酶進(jìn)行平末端處理。對(duì)于平末端的PCR產(chǎn)物還需要進(jìn)行磷酸化處理，使其5磷酸化。粘性末端連接：1、酶切克隆：在PCR引物的5端引入與載體匹配，不同識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)酶切位點(diǎn)，載體使用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切，進(jìn)行連接，通?？梢缘玫蕉ㄏ蚩寺〉慕Y(jié)果。2、TA克?。篢A克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，它用PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。TA克隆沒(méi)有方向性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 科技名詞定義中文名稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 英文名稱：polymerase chain reaction;PCR 定義1：用引物和DNA聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增特定的DNA區(qū)域的一種技術(shù)。 所屬學(xué)科： 生態(tài)學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ；分子生態(tài)學(xué)(二級(jí)學(xué)科) 定義2：體外酶促合成特異脫氧核糖核酸片段的技術(shù)。 所屬學(xué)科： 水產(chǎn)學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ；水產(chǎn)生物育種學(xué)(二級(jí)學(xué)科) 定義3：通過(guò)DNA互補(bǔ)雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環(huán)來(lái)擴(kuò)增DNA特定序列的方法。 所屬學(xué)科： 細(xì)胞生物學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ；細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)(二級(jí)學(xué)科) 定義4：由穆利斯(K. B. Mullis)于1988年首創(chuàng)的一種在體外模擬發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)的DNA快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的復(fù)制過(guò)程的技術(shù)。 所屬學(xué)科： 遺傳學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ；分子遺傳學(xué)(二級(jí)學(xué)科) 本內(nèi)容由全國(guó)科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會(huì)審定公布 目錄隱藏概述 PCR原理 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 1. 1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 2. 2、PCR引物設(shè)計(jì) 3. 3、模板的制備 4. 4、PCR反應(yīng)條件的控制PCR步驟 1. 1.DNA變性 2. 2.退火 3. 3.延伸PCR檢測(cè) PCR反應(yīng)特點(diǎn) 1. 特異性強(qiáng) 2. 靈敏度高 3. 簡(jiǎn)便、快速 4. 對(duì)標(biāo)本的純度要求低PCR的循環(huán)參數(shù) 1. 1、預(yù)變性（Initial denaturation） 2. 2、循環(huán)中的變性步驟 3. 3、引物退火（Primer annealing） 4. 4、引物延伸 5. 5、循環(huán)數(shù) 6. 6、最后延伸PCR儀器 PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法 1. 1、實(shí)驗(yàn)室布局 2. 2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) 3. （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) 4. （二）標(biāo)本制備區(qū) 5. （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)概述PCR原理PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 1. 1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 2. 2、PCR引物設(shè)計(jì) 3. 3、模板的制備 4. 4、PCR反應(yīng)條件的控制PCR步驟 1. 1.DNA變性 2. 2.退火 3. 3.延伸PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)特點(diǎn) 1. 特異性強(qiáng) 2. 靈敏度高 3. 簡(jiǎn)便、快速 4. 對(duì)標(biāo)本的純度要求低PCR的循環(huán)參數(shù) 1. 1、預(yù)變性（Initial denaturation） 2. 2、循環(huán)中的變性步驟 3. 3、引物退火（Primer annealing） 4. 4、引物延伸 5. 5、循環(huán)數(shù) 6. 6、最后延伸PCR儀器 PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法 1. 1、實(shí)驗(yàn)室布局 2. 2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) 3. （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) 4. （二）標(biāo)本制備區(qū) 5. （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū) 編輯本段概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。 DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的Klenow PCR流程fragment of E. Coli則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性,因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)今所使用的酶(簡(jiǎn)稱Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 編輯本段PCR原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。 發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶-Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 編輯本段PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液10l4種dNTP混合物200l引物10100l模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水100 lPCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即: 引物(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。 引物有多種設(shè)計(jì)方法，與PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定。但基本原則相同 PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu。分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但已發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇 模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制 緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見(jiàn)的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu) 2、PCR引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5端引物和3引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴(kuò)增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴(kuò)增片段3端的一小段DNA序列互補(bǔ)。 引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 端的互補(bǔ)重疊。 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。 引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。 v 引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）* vOligo6 （引物評(píng)價(jià)） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在線服務(wù)） 3、模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。 標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。 4、PCR反應(yīng)條件的控制PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L 底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U（100ul） 引物 濃度一般為0.1 0.5umol/L 反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù) 變性溫度和時(shí)間 95，30s 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 左右，一般在4555 延伸溫度和時(shí)間 72，1min/kb（10kb內(nèi)） Tm值=4(G+C) 2(A+T) 循環(huán)次數(shù) :一般為25 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。 編輯本段PCR步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步： 1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示： 現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60-65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。 編輯本段PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。 編輯本段PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合； 堿基配對(duì)原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 靶基因的特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(g=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。 簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。 對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。 編輯本段PCR的循環(huán)參數(shù)1、預(yù)變性（Initial denaturation） 模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。 2、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間 變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 3、引物退火（Primer annealing）退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。 退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。 4、引物延伸引物延伸一般在72進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略 延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。 5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。 6、最后延伸在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72維持5-15分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。 （四）PCR中的污染和假陽(yáng)性 PCR中污染主要來(lái)自 1、樣品間交叉污染； 2、先前PCR產(chǎn)物遺留（carry-over） 編輯本段PCR儀器pcr儀器的發(fā)展 pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。自perkin elmercetus公司第一臺(tái)pcr擴(kuò)增儀問(wèn)世以來(lái)，現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)和銷售pcr擴(kuò)增儀。在短短的幾年間，擴(kuò)增儀經(jīng)過(guò)幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進(jìn)一步朝方便、實(shí)用、高智能化和自動(dòng)化的方向發(fā)展。 為了便于了解和選購(gòu)適宜的pcr實(shí)驗(yàn)設(shè)備，現(xiàn)將部分國(guó)內(nèi)外pcr擴(kuò)增儀列表如下；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。國(guó)產(chǎn)1109型dna擴(kuò)增儀則是用恒溫浴機(jī)械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b體積小，智能化與自動(dòng)化程序高，可以兼做套式pcr，方便實(shí)用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動(dòng)控制溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)，可以達(dá)到節(jié)省勞動(dòng)力的目的。在采用這些儀器作pcr試驗(yàn)之前，一般均應(yīng)實(shí)測(cè)管內(nèi)溫度變化循環(huán)情況，以了解升、降溫時(shí)管內(nèi)因熱傳導(dǎo)造成的溫度滯后情況和實(shí)際到達(dá)的最高、最低溫度，用于修正設(shè)計(jì)的循環(huán)參數(shù)。溫度滯后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響，這對(duì)變溫鋁塊式儀器影響更大些。對(duì)于配用制冷機(jī)式半導(dǎo)體元件致冷的儀器，在使用低于室溫的溫度來(lái)保冷pcr反應(yīng)后小管時(shí)，應(yīng)注意冷凝水的問(wèn)題，勿使流入儀器內(nèi)浸濕半導(dǎo)體元件而損壞儀器。 國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的幾種dna擴(kuò)增儀 1109型 北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合 機(jī)械臂 變溫水浴 電子調(diào)溫 400.5ml 16400元/臺(tái) 90a/b型 中科院遺傳所 機(jī)械臂 變溫水浴 電熱 14000元/臺(tái) ptc-51a/b型 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 變溫氣流 電子調(diào)兼作套式 300.5ml 12000元/臺(tái) dna thermal cycler perkin elmercetus(美) 變溫鋁塊 壓縮機(jī)致冷 480.5ml us $ 20000.- thermocycler 60 00 180 b.braun biotech (德) 變溫水浴98四檔 電熱,自來(lái)水冷卻 601.5ml 1001.5ml 1801.5ml dm 30000.- automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.(美) 變溫鋁塊25100 電熱,自來(lái)水冷卻 291.5ml 581.5ml us $4985.- us $7980.- grant autogen grant instrumant ltd(美) 變溫水浴099 電熱,自來(lái)水冷卻或加冷循環(huán)器 501.5ml or 501.5ml us $250. plus us $ 15.-for rack(x2) techne phc-1 phc-2 techne ltd.(英) 變溫鋁塊099三檔 電熱500w水冷100w 540.5ml 540.5ml 241.5ml 3383. 3997. - biooven biothrm corp(美) 變溫氣流 -150 115v 11a 200s of 496plate us $ 2990. - trio-thermo-block tb-1 biomertra(德) 半導(dǎo)體變溫 220v 320管 分別控溫 dm12900. - micro cycler e eppendorf(美) 變溫鋁塊 220v/100v 329管 us $ 3500. - PCR常見(jiàn)問(wèn)題 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 假陽(yáng)性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 克隆PCR產(chǎn)物 1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？ 最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液,50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4過(guò)夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4過(guò)夜。 2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。 3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？ A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。 如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。 B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。 例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。 鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為： 1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞 如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。 C）如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。 D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍(lán)斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。 4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？ A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4過(guò)夜。 B）插入片段帶有污染，使3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3-T缺失。 C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。 D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。 E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 酶及其濃度目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。 dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸