人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取ppt.ppt

人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取RT PCR的原理 方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用 第六組 人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取 真核細(xì)胞質(zhì)總RNA主要由rRNA 80 85 tRNA和核內(nèi)小分子RNA 10 15 mRNA 1 5 組成 其中rRNA tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中 分離提純RNA的目的 分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物 RNA的不穩(wěn)定性 由于核糖殘基的2 和3 位置帶有羥基 RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富 加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性 不易失活 所以需要RNA酶抑制劑來(lái)抑制RNA酶的活性 3 分離高質(zhì)量RNA RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值 1 常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯 DEPC 是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑 它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性 從而抑制酶的活性 異硫氰酸胍 目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑 它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活 它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái) 又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用 氧釩核糖核苷復(fù)合物 由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物 它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì) 幾乎能完全抑制RNA酶的活性 RNA酶的蛋白抑制劑 RNasin 從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白 RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 可以和多種RNA酶結(jié)合 使其失活 其它 SDS 尿素 硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用 2 RNA提取的一般步驟 RNA提取的一般步驟是 破碎組織 分離RNA 沉淀RNA 洗滌RNA 融解RNA 保存RNA 破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行可以用鹽酸胍 硫氰酸胍 NP 40 SDS 蛋白酶K等破碎組織加入 ME可以抑制RNA酶活性 分離RNA一半用酚 氯仿等有機(jī)溶劑 加入少量異戊醇 經(jīng)過(guò)此步 離心 RNA一般分布于上層 與蛋白層分開 沉淀RNA一般用乙醇 3MNaAc pH 5 2 或異丙醇 洗滌RNA使用70 乙醇洗滌 有時(shí) 為避免RNA被洗掉 此步可以省掉 洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇 但是不能過(guò)于干燥 否則不易溶解 融解RNA一般使用TE 保存RNA應(yīng)該盡量低溫 為了防止痕量RNase的污染 從富含RNase的樣品 如胰臟 肝臟 中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA 對(duì)于長(zhǎng)期貯存也應(yīng)該如此 由于RNA的種類來(lái)源很多 因而提取制備方法各異 本次介紹的是Trizol法制備RNA Trizol法提取RNA TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑 可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA 其含有苯酚 異硫氰酸胍等物質(zhì) 能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶 在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性 因此對(duì)純化RNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)十分有用 Trizol試劑主要成分是苯酚 苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞 使細(xì)胞中的蛋白 核酸物質(zhì)解聚得到釋放 苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì) 但不能完全抑制RNA酶活性 因此TRIzol中還加入了8 羥基喹啉 異硫氰酸胍 巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase RNA酶 Trizol試劑裂解細(xì)胞并釋放出RNA 酸性條件使RNA與DNA分離 加入氯仿后離心 樣品分成水樣層和有機(jī)層 RNA存在于水樣層中 收集上面的的水樣層后 RNA可以通過(guò)異丙醇以沉淀的方式還原 在除去水樣層后 乙醇能沉淀析出中間層的DNA 在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白 試劑 DEPC 焦碳酸二乙酯 氯仿 異丙醇 無(wú)水乙醇 0 05 0 1 DEPC H2O 75 乙醇 TE緩沖液 瓊脂糖 配制 1 DEPC水 1ml 1000ml雙蒸水 1 DEPC水 1000ml容量瓶中靜置4小時(shí) 2 75 乙醇 無(wú)水乙醇 DEPC水 20 保存 DEPC水需先高壓 實(shí)驗(yàn)用品 基本過(guò)程 一 抽提二 分相三 RNA沉淀四 RNA清洗 2020 3 10 16 可編輯 一 抽提 細(xì)胞抽提1 組織取材后用滅菌的錫箔紙包好保存于液氮 實(shí)驗(yàn)時(shí) 在液氮中將組織研磨成粉末 趁液氮未揮發(fā)將粉末轉(zhuǎn)移到EP管 室溫5000rpm離心去上清 每50 100mg組織 加入1mlTrizol 反復(fù)抽吸均勻 二 分相3 在裝有裂解物的離心管中加入0 2ml的氯仿 為Trizol總體積的1 5 振蕩混勻30秒 室溫下靜置5分鐘 4 12000rpm離心15分鐘4 C 分相為三層 上層 RNA 約為Trizol的60 中間 DNA 下層 蛋白質(zhì) 酚 氯仿 5 小心吸取上清液 轉(zhuǎn)移到另一EP管中 1ml裂解物產(chǎn)生的上清液體積約為0 4 0 6ml 有機(jī)相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì) 避免觸及 三 RNA沉淀6 上清液加入約0 5ml的異丙醇 振蕩30秒混勻 室溫下靜置10分鐘 7 4 C 離心12000rpm10分鐘 8 RNA沉淀將在離心底的側(cè)面形成 小心吸棄上清液 注意避免吸棄RNA沉淀 四 RNA清洗9 離心管加入1ml預(yù)冷的75 乙醇 1mlTrizol至少用1ml乙醇清洗DNA 振蕩混勻30秒 使沉淀振蕩起來(lái) 室溫離心12000rpm 1 2分鐘 盡可能吸棄上清液 防止RNA沉淀丟失 重復(fù)以上清洗步驟一次 在75 乙醇中 RNA在4 至少可以保存1周 20 至少可以保存1年 10 室溫選擇流動(dòng)性小 倒置離心管于濾紙上 干燥RNA 但不能完全干燥 5 10分鐘 用DEPC水15 l溶解沉淀 55 60 孵育10 15分鐘 11 測(cè)量OD值后 樣品放置 70 保存 一個(gè)月 RT PCR RT PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR 或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR reversetranscription PCR RT PCR 是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR 的一種廣泛應(yīng)用的變形 在RT PCR中 一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA 再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增 應(yīng)用RT PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù) 可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA 廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷 并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量 oligo 多聚體 相當(dāng)于mRNA引物AMVRT 禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶MMLVRT 莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs 脫氧核苷酸RNase RNA水解酶PCRBuffer RT PCR緩沖液MgCl2 2價(jià)鎂離子 基本過(guò)程由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA cDNA 稱作 逆轉(zhuǎn)錄 由依賴RNA的DNA聚合酶即逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)完成 隨后 DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成 隨每個(gè)循環(huán)倍增 即通常的PCR 原先的RNA模板被RNA酶H降解 留下互補(bǔ)DNA RT PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄 要求RNA模版為完整的且不含DNA 蛋白質(zhì)等雜質(zhì) 常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種 即鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒 avianmyeloblastosisvirus AMV 反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒 moloneymurineleukemiavirus MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法 借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用 核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同 電泳速度有差異而分離 這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法 與其他支持物電泳最主要區(qū)別是 它兼有 分子篩 和 電泳 的雙重作用 PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳檢測(cè)在基因