高中生物學(xué)中與DNA有關(guān)的6類(lèi)酶.doc

高中生物學(xué)中與DNA有關(guān)的6類(lèi)酶王彬 山東省東營(yíng)市河口區(qū)一中 山東東營(yíng)257200夏焦兵 安徽省宣城市第三中學(xué) 安徽宣城242000摘 要 高中生物學(xué)中涉及到與DNA 有關(guān)的6類(lèi)酶： DNA酶、解旋酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，對(duì)這6類(lèi)酶的有關(guān)知識(shí)作一綜述，并提出了相應(yīng)教學(xué)建議，以期對(duì)同行的教學(xué)起到幫助作用。關(guān)鍵詞 DNA酶 解旋酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 限制酶 DNA連接酶 1 DNA酶DNA酶，也稱(chēng)脫氧核糖核酸酶，是水解DNA中磷酸二酯鍵，生成低級(jí)多核苷酸或單核苷酸的磷酸二酯酶1。其中能夠水解DNA分子內(nèi)磷酸二酯鍵的酶又稱(chēng)為DNA內(nèi)切酶，如DNA酶I（DNase I），DNA酶II（DNase II）等；而從DNA鏈的一端逐個(gè)水解下核苷酸的酶稱(chēng)為DNA外切酶，如牛脾磷酸二酯酶和蛇毒磷酸二酯酶等非專(zhuān)一性核酸酶（底物也可為RNA）。在DNase I的作用下，DNA被水解成3端為游離羥基，5端為磷酸基團(tuán)的寡聚脫氧核苷酸，其平均長(zhǎng)度為4個(gè)脫氧核苷酸殘基。在DNase II的作用下，DNA被水解成5端為游離羥基，3端為磷酸基團(tuán)的寡聚脫氧核苷酸，平均長(zhǎng)度約6個(gè)核苷酸殘基。牛脾磷酸二酯酶可從DNA的5羥基端開(kāi)始逐個(gè)切割磷酸二酯鍵，蛇毒磷酸二酯酶可從DNA的3羥基端開(kāi)始逐個(gè)切割磷酸二酯鍵2。人教版高中生物必修2教材中，艾弗里等“證明DNA是遺傳物質(zhì)” 的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)就用到了DNA酶。在該酶作用下，載有S型肺炎雙球菌莢膜遺傳信息的DNA被分解破壞，無(wú)法將R型菌轉(zhuǎn)化成S型，從而進(jìn)一步證明了DNA是轉(zhuǎn)化因子。2 解旋酶DNA分子的許多生物學(xué)功能都需要解開(kāi)雙鏈才能執(zhí)行，而解旋酶就能通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA。解旋酶每解開(kāi)一對(duì)堿基，需要水解2分子ATP。分解ATP的活性依賴(lài)于單鏈DNA的存在。如果雙鏈DNA中有單鏈末端或缺口，則解旋酶可以首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動(dòng)。解開(kāi)的兩條單鏈隨機(jī)被單鏈結(jié)合蛋白所覆蓋，以防止重新結(jié)合成雙鏈或被核酸酶降解3。高中生物教材明確提到了DNA復(fù)制需要解旋酶，但轉(zhuǎn)錄是否需要解旋酶？教材并未明確指出，不少中學(xué)教師對(duì)此也是模糊不清。事實(shí)上，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，原核生物通過(guò)RNA聚合酶的特定亞基使DNA雙鏈解開(kāi)，也就是說(shuō)，RNA聚合酶自身具有解旋的功能；而真核生物轉(zhuǎn)錄時(shí)，是某些蛋白轉(zhuǎn)錄因子（如RNA聚合酶的TF-F 和TF-H）協(xié)助RNA聚合酶形成復(fù)合物解開(kāi)DNA雙鏈，起到解旋酶的作用4。解旋酶有多種，高中所謂的解旋酶一般是指在DNA復(fù)制過(guò)程中起作用的解旋酶。3 DNA聚合酶DNA聚合酶最早是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，以后陸續(xù)在其他原核生物中找到。DNA聚合酶是DNA復(fù)制過(guò)程中必不可少的酶。在DNA聚合酶催化的DNA鏈延長(zhǎng)反應(yīng)中，鏈的游離3-OH對(duì)進(jìn)入的脫氧核糖核苷三磷酸（DNA合成原料）的磷原子發(fā)生親核攻擊，從而形成3，5-磷酸二酯鍵并脫下焦磷酸（PPi）。形成磷酸二酯鍵所需要的能量來(lái)自-與-磷酸基之間高能鍵的裂解?？梢?jiàn)，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA無(wú)需額外加入ATP（某些中學(xué)教輔資料對(duì)此尚存錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)）。聚合反應(yīng)是可逆的，但隨后焦磷酸的水解可推動(dòng)反應(yīng)的完成。DNA聚合酶只能催化脫氧核苷酸加到已有核酸鏈的游離3-OH上，而不能催化子鏈的從頭合成，也就是說(shuō)，它需要引物鏈的存在。加入的核苷酸則由模板鏈所決定。引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA模板鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為2030個(gè)核苷酸。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制引物為RNA短鏈，而利用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增DNA用DNA短鏈作引物3 5。大腸桿菌中共含有5種不同的DNA聚合酶，分別稱(chēng)為DNA聚合酶、。在復(fù)制中起主要作用的是DNA聚合酶。DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性，能切除單鏈DNA的3末端核苷酸，而對(duì)雙鏈DNA不起作用，故不能形成堿基對(duì)的錯(cuò)配核苷酸可被該酶水解下來(lái)，從而降低復(fù)制的錯(cuò)誤率。DNA聚合酶還具有53核酸外切酶活性，它只作用于雙鏈DNA的堿基配對(duì)部分，從5末端水解下核苷酸或寡核苷酸，因而該酶被認(rèn)為在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起重要作用。DNA半不連續(xù)合成中岡崎片段5端RNA引物的切除也有賴(lài)于此外切酶，以保證DNA連接酶將片段連接起來(lái)。DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性，但無(wú)53外切酶活性，主要在DNA修復(fù)中起作用。DNA聚合酶和是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的，它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)3。真核生物中存在3種DNA聚合酶6，依次稱(chēng)為DNA聚合酶、，基本性質(zhì)和細(xì)菌DNA聚合酶相同，但一般不具有核酸外切酶活性。目前認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制中起關(guān)鍵作用的是DNA聚合酶。高中生物教材不僅在講述DNA復(fù)制內(nèi)容時(shí)涉及到DNA聚合酶，還在介紹PCR技術(shù)時(shí)，提到了熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。Taq酶是科學(xué)家從生活在高溫泉水中的一種棲熱水生菌（Thermus aquaticus）中分離純化得到的。因此，Taq酶的一個(gè)突出特點(diǎn)是能耐PCR過(guò)程中的高溫。一次加入Taq酶即可滿足PCR全過(guò)程需求，相對(duì)于應(yīng)用不耐熱的Klenow聚合酶的最初PCR技術(shù)，操作簡(jiǎn)化的同時(shí)還提高了PCR產(chǎn)物特異性7。該酶的發(fā)現(xiàn)使PCR技術(shù)才真正成熟，并得以廣泛應(yīng)用。4 逆轉(zhuǎn)錄酶人教版高中生物必修2在講述中心法則的發(fā)展時(shí)，提到了逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶能以RNA為模板合成DNA。人教版選修3在講述cDNA文庫(kù)的構(gòu)建時(shí)，提到了反（逆）轉(zhuǎn)錄過(guò)程，該過(guò)程也依賴(lài)于逆轉(zhuǎn)錄酶。另外，人教版高中生物必修1介紹了有關(guān)細(xì)胞衰老的端粒假說(shuō)。端粒的修復(fù)和延伸?有賴(lài)于端粒酶催化。研究人員對(duì)四膜蟲(chóng)（Tetrahymena thermophila）的端粒酶進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)該酶由RNA和蛋白質(zhì)2部分構(gòu)成，其蛋白質(zhì)部分就具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性8。逆轉(zhuǎn)錄酶催化的DNA合成反應(yīng)需要模板和引物，以四種脫氧核苷三磷酸為底物，此外還需要適當(dāng)濃度的二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+和Mn2+）和還原劑，以保護(hù)酶蛋白中的巰基，DNA鏈的延伸方向?yàn)?3?，F(xiàn)在知道，逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它兼有三種酶的活力：（1）它可以RNA為模板，在其上合成一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNADNA雜種分子（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力）。（2）它還可以在新合成的DNA鏈上合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子（DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力）。（3）除了聚合酶活力外，它還有核糖核酸酶H的活力，專(zhuān)門(mén)水解RNADNA雜種分子中的RNA，起核酸外切酶的作用1。5 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶，主要從微生物產(chǎn)生，能識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。因此，從科學(xué)的角度看，限制性核酸內(nèi)切酶其實(shí)也是前文所述DNA酶的一種。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)限制酶與DNA甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，利用限制酶降解進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源DNA，同時(shí)用甲基化酶修飾細(xì)菌本身DNA，以避免被酶降解7。根據(jù)限制酶識(shí)別和切割DNA 的特點(diǎn)，可將限制酶分為、三種類(lèi)型，型和型由于無(wú)切割特異性或特異性不強(qiáng)故不用于基因工程，型限制酶特異性最強(qiáng)，用處最大，是基因工程的重要工具酶，通常所說(shuō)的限制性核酸內(nèi)切酶即指此類(lèi)酶。型限制酶的識(shí)別序列通常由48個(gè)堿基對(duì)組成，且在兩條鏈上反向重復(fù)，如EcoR的識(shí)別序列在一條鏈上是5?-GAATTC-3?，在另一條鏈上就是3?-CTTAAG-5?。切割后形成的片段末端，雙鏈等長(zhǎng)的稱(chēng)平末端，不等長(zhǎng)的稱(chēng)黏性末端。有些來(lái)源不同的限制酶能識(shí)別和切割相同的序列，稱(chēng)為同裂酶。同裂酶產(chǎn)生同樣切割，形成同樣的末端，酶切后所得到的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，仍可能被原來(lái)的限制酶所切割。有些來(lái)源不同的限制酶，識(shí)別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的黏性末端，稱(chēng)為同尾酶。但兩種同尾酶切割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，不能被原來(lái)的限制酶所識(shí)別和切割7。限制酶在基因工程中的應(yīng)用是近年來(lái)很多省市高考命題的一個(gè)熱點(diǎn)，教師尤其要注意提醒學(xué)生它和高中意義上的DNA酶的作用區(qū)別。6 DNA連接酶DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5?端磷酸與3?端羥基之間形成磷酸二酯鍵。它既能催化雙鏈DNA中單鏈切口的封閉（如細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)岡崎片段的連接3），也能催化兩個(gè)雙鏈DNA片段進(jìn)行連接（如基因工程中目的基因與載體DNA的連接）。DNA連接酶主要來(lái)自T4噬菌體和大腸桿菌，相應(yīng)可分兩種：T4 DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。前者催化黏性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率高，催化反應(yīng)需要ATP提供能量；后者只能催化粘性末端連接，能量由NAD+提供7。DNA連接酶和DNA聚合酶有很大的相似性，學(xué)生極易混淆。為了幫助學(xué)生更好地區(qū)別，教師可借助圖示、比喻等方法突破學(xué)生認(rèn)知困難，在此基礎(chǔ)上，讓學(xué)生自行設(shè)計(jì)表格，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)二者進(jìn)行多角度比較。也有教師局限于高中教材的簡(jiǎn)單介紹，誤以為細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的子鏈延伸過(guò)程只需要DNA聚合酶，而不需要DNA連接酶9。現(xiàn)將教材中涉及的上述6類(lèi)酶的作用結(jié)果及特點(diǎn)概括如下：（備注：6類(lèi)酶是習(xí)慣名稱(chēng)，并不是相互獨(dú)立的酶，實(shí)際在內(nèi)涵上有交叉。表中在對(duì)6類(lèi)酶的作用比較時(shí)，僅取各類(lèi)酶在人教版高中生物教材中的含義。） 以上6類(lèi)與DNA有關(guān)的酶，主要分布在人教版必修2和選修3教材中，學(xué)習(xí)時(shí)間跨度較大。在新授課的教學(xué)中，教師只能按照它們?cè)诮滩闹谐霈F(xiàn)的先后次序指導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)，難免由于學(xué)習(xí)材料的相關(guān)性產(chǎn)生前攝和倒攝抑制10，從而影響學(xué)生對(duì)有關(guān)酶的學(xué)習(xí)。因此筆者建議教師在復(fù)習(xí)課的教學(xué)中，可以基因工程的實(shí)踐應(yīng)用為背景編制教學(xué)案例，通過(guò)基因工程的原理和遺傳的中心法則這一明一暗2條線索，將文中涉及的6類(lèi)酶的作用有機(jī)地貫穿起來(lái)，形成結(jié)構(gòu)化的知識(shí)體系，避免學(xué)生的機(jī)械記憶，增添學(xué)習(xí)興趣，提高教學(xué)效果。主要參考文獻(xiàn)1 沈同，王鏡巖生物化學(xué)（下冊(cè)）第2版北京：高等教育出版社，1991：297298，3523532 王運(yùn)坤，呂顯祿生物化學(xué)教程青島：青島出版社，1988：1411433 王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)法生物化學(xué)（下冊(cè)）第3版北京：高等教育出版社，2002：410423，580 4 譚艷華轉(zhuǎn)錄需要解旋酶嗎生物學(xué)教學(xué)，2012，（37）7：40-415 張惟杰，