線粒體COI基因克隆.doc

線粒體COI基因的分子克隆一、試劑材料1、500一800克重的活鯉魚和1500一2500克重的活草魚 各五條2、STE緩沖液(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L TrisHCI，1mmol/L EDTA，pH8.0) 1L3、STM緩沖液(0.25mol/L蔗搪，10mM TrisHCl，0.5mmol/L Mgcl2，PH8.0) 50mL4、DNasel 2mg5、0.5mol/L EDTA pH8.0 10mL6、NTE緩沖液(20mmol/L NaCI，20mmol/L TrisHCI，lmmol/L EDTA，pH8.0) 50mL7、20% SDS 8、苯酚 50ml9、3mol/L NaAC (pH 4.8) 5mL10、冷乙醇(100%) 50mL11、95%乙醇 200Ml 12、TE緩沖液(10mmol/LTrisHcl，1mmol/LEDTA，pH80)， 10mL13、10mg/ml DNA一freeRNaseA溶液（溶解RNase A 于TE 緩沖液中，濃度為 10mg/mL，煮沸1030min, 除去DNase 活性，-20貯存） 40ul 14、氯仿:苯酚:異戊醇 (Vl:V2:V3為 24:24:l) 49ml(24+24+1) 1、引物1 、引物22、 10PCR 緩沖液（ Buffer ） 3、 2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4、Taq酶5、瓊脂糖：1.0%；6、電泳緩沖液（50 TAE 電泳緩沖液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸餾水至100ml）7、溴化乙錠EB：5 l / 100 ml 8、溴酚藍指示劑14、限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、Hind II、Hind III和Pst l，16、氨芐青霉素(100ug/ml)的LB平板（胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g，NaCl 10g ，加水 至1000ml , 若配置固體培養(yǎng)基，則再加入15gAgar(瓊脂) 。）17、pUC19質粒DNA19、桿菌HB101菌株，20、感受態(tài)細胞HB101。二、工具材料1、剪刀 5把 不同大小2、鑷子 5個 不同大小3、燒杯 2個大的 4個小的4、移液管 （一般用移液槍）5、離心管 10個最大的6、培養(yǎng)皿 5個小的 10個大的7、三角錐瓶 4個6、定容瓶 2個50 m L 1個1L7、試管架 1個三、設備材料1、高壓滅菌鍋 2、無菌操作臺3、冰箱4、水浴鍋5、離心機6、玻璃勻漿器7、凝膠電泳系統(tǒng)8、紫外透射檢測儀9、PCR儀9、缺口轉譯標記試劑盒，10、質粒DNA限制酶消化分析及雜交探針系統(tǒng)11、硝酸纖維素濾膜13、同位素P32 標記的水稻線粒體Col探針 紫外透射檢測儀四、實驗步驟（一）魚肝線粒體DNA 的分離與純化1、按上面所寫準備實驗材料2、對實驗器材滅菌3、對魚預處理 刮鱗 消毒 取魚肝用STE緩沖液清洗 4、再加入STE緩沖液到 玻璃勻漿器 里冰浴中緩和勻漿 5、離心 轉頭在3000g 離心 30分鐘6、除去上層脂肪和管底細胞碎片 取上清液 繼續(xù)離心 20000g 離心30分鐘 得到粗提的線粒體沉淀。7、加入20ml STM緩沖液 2mgNasel 25水浴中保溫消化30分鐘8、取 0.8ml 0.5mol/L EDTA pH8.0 溶液加到消化液中，使終濃度為20mmol/L，終止酶解 反應。9、然后再加入160ml STE緩沖液，20000g下離心20分鐘，收集線粒體沉淀，重復用STE緩沖液漂洗線粒體二次，清除污染的核DNA10、把離心所得的線粒體沉淀懸浮在20ml的NTE緩沖液，加入20% SDS溶液 至終濃度為0.8%，放置在37水浴中保溫10分鐘。11、用等體積的苯酚抽提脫蛋白二次，留水相，12、用10分之1的 3mol/L NaAC 和二倍體積的冷乙醇(100%)，混勻后放在一20冰箱中沉淀過夜。13、離心收集mtDNA，真空干燥后溶于2.0ml的TE緩沖液, 加入40ul(10mg/ml)的DNA一free RNaseA溶液 置37水浴中保溫60分鐘。14、消化液再用氯仿:苯酚:異戊醇 抽提2一3次。水相加乙醇沉.淀DNA，并將離心收集的mtDNA經(jīng)真空干燥后，溶于適量的TE緩沖液中，貯于 20冰箱備用。（2） 線粒體CO I 基因的克隆1 PCR擴增（1）在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。10PCR buffer 5ldNTP mix（2mM ） 4l引物1（10pM） 2l引物2（10pM） 2lTaq酶（2U/l） 1lDNA模板（50ng-1g/l） 1l加ddH2O至 50l視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油（防止PCR過程中蒸發(fā)）。（2）調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93變性40s58退火30s72延伸60s，循環(huán)30-35次，最后在72保溫710min。2、1%的瓊脂糖凝膠電泳：（1）制膠（以60 mL為例） A、稱取0.6 g瓊脂糖，加入60 ml的TAE緩沖液（pH 8.0），搖勻； B、電爐加熱，至瓊脂糖完全溶解（要防止過熱溢出三角瓶; 用東西蓋上，防止揮發(fā) ）； C、將制膠板放入制膠槽中，插入適當?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50）加入2ul EB后，混均勻，倒入其中，直至厚度為46 mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30 45 min)； D、將制膠板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。（2）點樣 (如在反應管中加有石蠟油，需用100L氯仿進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10l電泳檢測) 用移液槍將5 l含溴酚藍的擴增產(chǎn)物加入點樣孔下部。（3）電泳 打開電源開關，調節(jié)電壓至35V/cm(約100V)，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，約30-40分鐘后即可觀察結果。（4）觀察 將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該樣品DNA的濃度。如同時有已知分子量的標準DNA（mark）進行電泳，則可通過性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。3、 大腸桿菌感受態(tài)細胞HB101的制備及轉化準備： 一. 材料 E. coli DH5菌株: R,M,Amp；pBS質粒DNA: 購買或實驗室自制，eppendorf管。 二. 設備 恒溫搖床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機, 分光光度計,微量移液槍。 3. 試劑 1.LB固體和液體培養(yǎng)基 2.Amp母液 3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60左右,加 入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。 4.麥康凱培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。 5、0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。 6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。 操作步驟： （1）受體菌的培養(yǎng) 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600 0.5左右。 （2）感受態(tài)細胞的制備 ( CaCl2 法) A、將培養(yǎng)液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4下3000g（離心力）離心10分鐘。 B、 棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后,4下3000g離心10分鐘。 C、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液。 D、 感受態(tài)細胞分裝成200l的小份,貯存于-70可保存半年。 （3）轉化 A、從-70冰箱中取200l感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。 B、 加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10l),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。 C、42水浴中熱擊90秒或37水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。 D、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37振蕩培養(yǎng)1小時,使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。 E、將上述菌液搖勻后取100l 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)16-24小時。 同時做兩個對照: 對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現(xiàn)。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產(chǎn)生大量菌落。 （4）計算轉化率 統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉化子總數(shù)和轉化頻率，公式如下： 轉化子總數(shù)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉化反應原液總體積涂板菌液體積 轉化頻率（轉化子數(shù)每mg質粒DNA）轉化子總數(shù)質粒DNA加入量(mg) 感受態(tài)細胞總數(shù)對照組2菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積涂板菌液體積 感受態(tài)細胞轉化效率轉化子總數(shù)感受態(tài)細胞總數(shù) 注意 本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,涂板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。14、pUC19質粒DNA的制備 16、southern轉移及雜交系統(tǒng)的制備 注意(A)加人適量的DNasel處理粗提的線粒體，以消除粘附在線粒體顆粒表面的核DNA;(B)用新鮮的而不是用冰凍的魚肝組織提取mtDNA。因為我們在實驗中注意到，用冰凍的肝組織往往得率低，而且核DNA的污染也更為嚴重，這可能同冰凍組織核膜容易破裂有關;(C)選用疏松的玻璃勻漿器取代電動高速勻漿器作緩和的勻漿，一般上下勻漿3一4次即可。如此操作既可使細胞膜破裂釋放出線粒體顆粒，又可避免或減少細胞核膜的破裂。這樣便很好地解決了核DNA的污染問題，得到了純化的草魚和鯉魚mtDNA。純化的mtDNA酶切效果好，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，DNA譜帶清晰，明顯無背景核DNA的污染。此外，按我們發(fā)展的程序純化魚肝組織的mtDNA，通常每100克鮮肝組織的得率可達30一50微克mtDNA，而且避免了氯化艷密度梯度離心法藥品昂貴、設備復雜、實驗周期長等多方面的缺點。 瓊脂糖凝膠電泳的制備一、實驗原理 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5ng以上的DNA。1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素： 1)DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超螺旋線性DNA） 2)瓊脂糖濃度：不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose：0.5%：1-30 kb；0.7%：0.8-12 kb1.2%：0.4-7 kb；1.5%：0.2-3 kb. 3)DNA構象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán) 4)所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5V/cm 5)堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 6)嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中) 7)電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。3電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍呈藍紫色；二甲苯晴呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。4、電泳緩沖液：TAE TBETAE與TBE不同之處在于TBE用硼酸代替了TAE中的冰醋酸。 植物基因組DNA提取方法 植物基因組DNA的提取通常采用機械研磨的方法，由于植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧 化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并可減少研磨過程中各種酶類的作用。 十 二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使 蛋白質變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入無水乙醇使DNA沉 淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。 一.CTAB法CTAB(十 六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復合物與蛋白，多糖類物質分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙 醇而除去。 1.試劑準備 (1)2CTAB抽提緩沖溶液: 100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的-巰基乙醇。 (2)TE 緩沖液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。 (3)DNase-free RNase A: 溶解RNase A 于TE 緩沖液中，濃度為10mg/mL，煮沸10 30min, 除去DNase 活性，-20貯存。 (4)氯仿-異戊醇混合液（24:1，V/V）：240mL 氯仿（A.R.）加10mL 異戊醇（A.R.）混勻。 (5)3mol/L 乙酸鈉（NaAc，pH6.8）：稱取NaAc3H2O 81.62g，用蒸餾水溶解，配制成200mL，用HAc 調pH 至6.5。 2. 實驗步驟 (1)在2mL離心管中，加入500l的2CTAB和20 l -巰基乙醇, 65預熱。 (2)稱取新鮮葉片1-2g，用蒸餾水沖洗干凈，再用無菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到預熱的離心管中，總體積達到1mL混勻后置65水浴中保溫45-60min，并不時輕輕轉動試管。 注：凍存材料直接研磨，絕對不能化凍。而且粉末應在化凍前轉移否則內(nèi)源性Dnase有可能降解基因組DNA。 (3)加入1/10體積的3mol/L的乙酸鈉充分混勻，在冰浴中放置30 min中，4C 12000 rpm離心5 min，吸上清。注意，對于幼嫩葉片此步可以省略。對成熟的老葉片需采用。 (4)加等體積的氯仿/異戊醇（24：1），輕輕地顛倒混勻，室溫下12 000rpm離心10 min。 (5)移上清至另一新管中，用氯仿/異戊醇重復抽提一次。 (6)移上清至另一新管中，向管中加入1/10體積的RNase A溶液，置37 20-30min。 (7)氯仿/異戊醇抽提后，加入2倍體積的100%乙醇或0.7倍體積異丙醇，會出現(xiàn)絮狀沉淀，-20放置30 min，12 000rpm離心10-15min回收DNA沉淀。 (8)用70%乙醇清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅菌TE緩沖液中。 (9)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。用紫外分光光度計測定DNA濃度。 二.SDS法 SDS法的基本原理是研磨的組織細胞用熱的SDS裂解后，加入高濃度的KAc，0放置以除去蛋白和多糖類雜質，最后用乙醇或異丙醇沉淀。 1.試劑準備 (1)提取緩沖液 Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0） EDTA 50mmol/L （pH8.0） NaCl 500 mmol/L 滅菌后加-巰基乙醇至10 mmol/L (2)裂解液20%SDS (3)高鹽溶液5mol/L KAc (4)RNaseA 10mg/ml 2.實驗步驟 (1)取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到加有500L提取液的離心管中,輕輕混勻。 (2)向管中加入50L 20%SDS溶液，混勻，不可過于強烈震蕩以防基因組DNA斷裂 ，65保溫10min，并不時搖動。 (3)加入150L 5mol/L KAc，混勻，置冰上20-30 min。 (4)4,15 000rpm離心15min,轉移上清到另一離心管中，加入0.7倍體積的異丙醇，混勻，-20沉淀30 min 。 (5)12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。 (6)加入1/10體積的RNaseA，37保溫20min，除去RNA。 (7)氯仿抽提后，加2倍體積乙醇，-20沉淀30 min 。12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。 (8)用400L 70%乙醇洗兩次后，吹干，加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。 (9)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。用紫外分光光度計測定DNA濃度。 PHS3C型精密PH計安全操作規(guī)程一.PH計使用前準備的工作 1.使用PH計之前先用三蒸水清洗電極，注意玻璃電極不要碰碎。 2.準備在平臺PH計的旁邊放至調節(jié)用的NAOH液和HCL液。 3.在冰箱中拿出定PH液(PH=7.0),放與平臺上。 4.打開PH計，調定PH值，按鍵選擇PH和CAL選項，選擇其中的CAL項，調節(jié)插入到PH液(PH=7.0)中，按鍵選擇數(shù)據(jù)值到7.0處，出現(xiàn)小八叉即可。 5.將玻璃電極插入到待測的溶液中，再放入另一電極，適當?shù)臄噭右好妫ㄗ⒁猓翰灰鏊椴Ａщ姌O）。 6.PH計的電子單元使用必須注意電路的保護，在不進行PH值測量時，要將PH計的輸入短路，以避免PH計的損壞。 7.PH計的玻璃電極插座必須保持干凈、清潔和干燥，不能接觸鹽霧和酸霧等有害氣體，同時嚴禁玻璃電極插座上沾有任何的水溶液，以避免PH計高輸入阻抗。 8.未到你需要的PH值時要小心的加如NAOH液和HCL液，（據(jù)調節(jié)范圍不同可以選擇不同濃度的調節(jié)液，濃度小時可以快加，濃度大時要加慢）。 9.加液時小心不要超過所需的定容量。二.PH計使用方法 1.后蓋打開，裝入電池一塊。 2.裝上復合玻璃電極注意：(1)復合電極下端是易碎玻璃泡，使用和存放時千萬要注意，防止與其它物品相碰。 (2)復合電極內(nèi)有KCl飽和溶液作為傳導介質，如干涸結果測定不準必須隨時觀察有無液體，發(fā)現(xiàn)剩余很少量時到化驗室灌注。(3)復合電極儀器接口決不允許有污染，包括有水珠。(4)復合電極連線不能強制性拉動，防止線路接頭斷裂。 3.打開電源開關后，再打到PH測量檔。 4.用溫度計測量PH6.86標準液的溫度，然后將PH計溫度補償旋鈕調到所測的溫度值下。 5.將復合電極用去離子水沖洗干凈，并用濾紙擦干。 6.將PH6.86標準溶液25ml倒入已用水洗凈并擦干的塑料燒杯中，洗滌燒杯和復合電極后倒掉，再加入20mlPH6.86標準溶液于塑料燒杯中，將復合電極插入于溶液中，用儀器定位旋鈕，調至讀數(shù)6.86，直到穩(wěn)定。應該注意以下兩點：(1)必須用PH6.86標準調定位。(2)調完后，決不能再動定位旋鈕。 7.將復合電極用去離子水洗凈，用濾紙擦干，用溫度計測量PH4.00溶液的溫度，并將儀器溫度補償旋鈕調到所測的溫度值下。 8.將PH4.00標準溶液25ml倒入另一個塑料燒杯中，洗滌燒杯和復合電極后倒掉，再加入20mlPH4.00標準溶液，將復合電極插入溶液中，讀數(shù)穩(wěn)定后，用斜率旋鈕調至PH4.00。應該注意斜率鈕調完后，決不能再動。 9.用溫度計測定待測液溫度，并將儀器溫度補償調至所測溫度。 10.將復合電極插入待測溶液中，讀取PH值，即為待測液PH值。應該注意以下兩點：(1)測定時溫度不能過高