DNA重組技術(shù)的基本工具(講課)

選修3 你還記得我們嗎 氫鍵磷酸二酯鍵DNA聚合酶限制性內(nèi)切酶DNA連接酶運載體 專題1 基因工程的基本內(nèi)容 基因工程的概念 1 1基因工程的基本工具 1 2基因工程的基本操作程序 基因工程的發(fā)展史 1 3基因工程的應(yīng)用 1 4蛋白質(zhì)工程的崛起 基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望 進行嚴(yán)格的設(shè)計 并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù) 賦予生物以新的遺傳特性 從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品 由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的 因此又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù) 別名 操作環(huán)境 原理 操作水平 結(jié)果 基因工程是指按照人們的愿望 進行嚴(yán)格的設(shè)計 并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù) 賦予生物以新的遺傳特性 從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品 由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的 因此又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù) 基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù) 生物體外 基因重組 DNA分子水平 定向地改造生物的遺傳性狀 獲得人類所需要的品種 基因工程的產(chǎn)物 這就要用到定向改造生物的新技術(shù) 基因工程 基因工程的概念 基因工程的發(fā)展史 自學(xué)了解 普通棉花抗蟲棉 基因工程培育抗蟲棉的簡要過程 普通棉花 無抗蟲基因 蘇云金芽孢桿菌 提取 抗蟲基因 與運載體DNA拼接導(dǎo)入 棉花細胞 含抗蟲基因 轉(zhuǎn)基因棉花植株 上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么 解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具 分子手術(shù)刀 限制性核酸內(nèi)切酶 分子縫合針 DNA連接酶 分子運輸車 運載體 1 簡稱 2 分布 一 限制性核酸內(nèi)切酶 分子手術(shù)刀 主要在原核生物中 限制酶 尋根問底 P4 你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎 原核生物易受自然界外源DNA的入侵 但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制 以防止外來病原物的侵害 限制酶就是細菌的一種防御性工具 當(dāng)外源DNA侵入時 會利用限制酶將外源DNA切割掉 以保證自身的安全 所以 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 使之失效 從而達到保護自身的目的 限制酶在原核生物中的作用 思考與探究P7 2 為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA 通過長期的進化 含有某種限制酶的細胞 其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列 或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上 使限制酶不能將其切開 這樣 盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷 并且可以防止外源DNA的入侵 以中軸線雙側(cè)的DNA上堿基呈反向?qū)ΨQ 重復(fù)排列如 GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC 限制酶所識別的序列有什么特點 專一性 限制酶的識別特點 3 特點 識別特定核苷酸列 切割特定切點 專一性 4 切點 磷酸二酯鍵 EcoR 黏性末端 黏性末端 Goback 中心軸線兩側(cè)切開 什么叫黏性末端 被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口 帶有幾個伸出的核苷酸 它們之間正好互補配對 這樣的切口叫黏性末端 Sma 平末端平末端 中心軸線處切開 4 結(jié)果 產(chǎn)生黏性未端和平末端 以中軸線雙側(cè)的DNA上堿基呈反向?qū)ΨQ重復(fù)排列如 GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC 限制酶所識別的序列有什么特點 3 特點 4 結(jié)果 1 簡稱 2 分布 一 限制性核酸內(nèi)切酶 主要在原核生物中 限制酶 識別特定核苷酸列 切割特定切點 專一性 產(chǎn)生黏性未端或平末端 要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口 可產(chǎn)生幾個黏性 平 末端 要切兩個切口 產(chǎn)生四個黏性 平 末端 如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割 會怎樣呢 會產(chǎn)生相同的黏性 平 末端 然后讓兩者的黏性 平 末端黏合起來 就似乎可以合成重組的DNA分子了 思考 Goback GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoR GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 不同來源的DNA片段混合 將不同種來源的DNA片段連接起來 生物A基因片段 生物B基因片段 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 酶切 1 作用 把DNA片段拼接成新的DNA 2 作用原理 催化磷酸二酯鍵形成 不是氫鍵 二 DNA連接酶 分子縫合針 可把黏性末端之間的縫隙 縫合 起來 即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 T4DNA連接酶 3 類型 E coliDNA連接酶 T4DNA連接酶 來源 功能 大腸桿菌 T4噬菌體 只能連接黏性末端 能連接黏性末端和平末端 尋根問底 P6 DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎 為什么 將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上 形成磷酸二酯鍵 在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵 作用對象 DNA復(fù)制 基因重租 4 DNA連接酶與DNA聚合酶比較 3 類型 E coli DNA 連接酶 來源 大腸桿菌 作用特點 只連接黏性末端 T 4 DNA 連接酶 來源 T 4 噬菌體 作用特點 連接黏性末端和平末端 2 作用原理 催化磷酸二酯鍵形成 1 作用 二 DNA連接酶 把DNA片段拼接成新的DNA 1 載體必須具備的條件 能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存 具有一至多個限制酶切點 以便與外源基因連接 具有某些標(biāo)記基因 便于進行篩選 對受體細胞無害 三 基因進入受體細胞的載體 分子運輸車 2 常用的載體 質(zhì)粒 噬菌體的衍生物 動植物病毒等 能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制 有切割位點 有標(biāo)記基因 3 質(zhì)粒 本質(zhì) 小型環(huán)狀DNA分子 分布 許多細菌 酵母菌等生物 三 運載體 1 質(zhì)粒 2 需要的條件 有1 多個限制酶切點 能在受體細胞中自我復(fù)制 或整合到受體細胞的染色體DNA上復(fù)制 有某些標(biāo)記基因 供重組DNA的鑒定和選擇 對受體細胞無害3 常用運載體 質(zhì)粒 噬菌體的衍生物或某些動植物病毒 1 在基因工程中 切割運載體和含有目的基因的DNA片段 需使用 同種限制酶B 兩種限制酶同種連接酶D 兩種連接酶 反饋練習(xí) 2 不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A 能復(fù)制 B 有多個限制酶切點C 具有標(biāo)記基因D 它是環(huán)狀DNA D 4 下列說法正確的是 A 限制酶的切口一定是GAATTC堿基序列B 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C 重組技術(shù)所用的工具酶是限制酶 連接酶 運載體D 利用運載體在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制的過程可稱為 克隆 審題 2和7能連接形成 ACGT TGCA 4和8能連接形成 GAATTC CTTAAG 3和6能連接形成 GCGC CGCG 1和5能連接形成 CTGCAG GACGTC 教材P7思考與探究1 1 1944年艾弗里 O Avery 等進行了肺炎雙球菌體外轉(zhuǎn)化實驗 證明了DNA是生物的遺傳物質(zhì) 并且證明了DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體 成為基因工程的先導(dǎo) 基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程 科技探索之路 20世紀(jì)中葉 基礎(chǔ)理論取得了重大突破 2 1953年沃森和克里克建立了雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 使生物學(xué)進入分子水平 1958年梅塞爾松和斯塔爾 以大腸桿菌為實驗材料 運用同位素示蹤技術(shù) 用實驗證明了DNA的復(fù)制是以半保留方式進行的 1957年克里克提出中心法則的確立 3 1963年尼倫伯格和馬太做蛋白質(zhì)體外合成實驗 破譯編碼氨基酸的遺傳密碼 1 基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2 工具酶的發(fā)現(xiàn)3 DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明 技術(shù)發(fā)明命使基因工程的實施成為可能 1967年羅思和赫林斯基發(fā)現(xiàn)細菌質(zhì)粒有自我復(fù)制能力 為基因轉(zhuǎn)移找到一種運載工具 1970年阿爾伯 W Arber 內(nèi)森斯 D Nathans 史密斯 H C Smith 細菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制酶 1977年科學(xué)家又發(fā)明了DNA序列分析方法 1965年桑格發(fā)明了氨基酸序列分析技術(shù) 4 DNA體外重組的實現(xiàn) 1972年伯格 P Berg 首先在體外進行了DNA改造的研究 成功地構(gòu)建了第一個人工體外重組DNA分子 1973年博耶和科恩使重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌中 轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA 并使外源基因可以在原核細胞中成功表達 至此表明基因工程正式問世 1973年科學(xué)家才將質(zhì)粒作為基因的載體使用 這是基因工程發(fā)展史上第一個成功的基因克隆實驗 1973年科恩第一個建成 基因工程菌 并創(chuàng)立基因工程模式 1973年稱這 基因工程元年 科恩被稱為基因工程發(fā)展史上的創(chuàng)始人 科恩并向美國申報了世界上第一個基因工程的專利