發(fā)酵調控學1

發(fā)酵技術與調控,郭美錦生物工程學院,課程內容,1 微生物生長分化調節(jié)的規(guī)律(1)細胞周期內有關生長的活動，DNA合成與細胞分裂的調節(jié)(2)絲狀菌生長分化的調節(jié)2 初級代謝的調節(jié)機制(1)調節(jié)的生化基礎(2)代謝調節(jié)的方式與內容：誘導、分解代謝物調節(jié)、反饋調節(jié),課程內容,3 次級代謝物的生物合成的調節(jié)(1)次級代謝物的概念(2)生物合成的前體(3)次級代謝物的生物合成(4)抗生素生物合成的控制,課程內容,4 發(fā)酵過程控制(1)控制的策略(2)參數(shù)的指導作用(3)參數(shù)相關分析(4)過程控制的評價,主要參考書,現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調控學，儲炬，李友榮，化學工業(yè)出版社，北京。2002年1月Biotechnology, 2nd ed. Vol.1; Biological Fundamentals. Rehm H-JBBiotechnology, 3nd ed Vol.3;Bioprocessing. Rehm H-JB,緒論,一、發(fā)酵調控 學開設的必要性、目的意義全稱：發(fā)酵過程微生物的內在調節(jié)與外部控制發(fā)酵工藝向來被認為是門藝術而不是科學，完全憑經(jīng)驗操縱。盡管生物系統(tǒng)發(fā)酵過程極其復雜，但由于有許多相關學科(生物化學、分子遺傳學、計算科學)的迅速發(fā)展，有可能把一些表面現(xiàn)象和菌的內在本質聯(lián)系起來。,發(fā)酵(Fermentation ),定義：細菌和酵母等微生物在無氧條件下，酶促降解糖分子產生能量(ATP)的過程。(底物水平磷酸化),發(fā)酵(Fermentation ),通過微生物（或動植物細胞）的生長培養(yǎng)和化學變化，大量產生和積累專門的代謝產物的反應過程 (電子水平氧化),NADH,微生物生理學嚴格定義的“發(fā)酵”,有機物被生物體氧化降解成氧化產物并釋放能量的過程統(tǒng)稱為生物氧化。 微生物生理學把生物氧化區(qū)分為和發(fā)酵.呼吸(Rispiration): 有機體利用氧氣通過代謝分解有機化合物釋放化學能的過程 呼吸又可進一步區(qū)分為有氧呼吸和無氧呼吸。因此，發(fā)酵是生物氧化的一種方式。,工業(yè)生產上定義的發(fā)酵“工業(yè)發(fā)酵”,工業(yè)生產上籠統(tǒng)地把一切依靠微生物的生命活動而實現(xiàn)的工業(yè) 生產均稱為“發(fā)酵”。這樣定義的發(fā)酵就是“工業(yè)發(fā)酵”。工業(yè)發(fā)酵要依靠微生物的生命活動，生命活動依靠生物氧化提供的代謝能來支撐，因此工業(yè)發(fā)酵應該覆蓋微生物生理學中生物氧化的所有方式： 有氧呼吸: C6H12O6+6O2CO2+12H2O+ATP 無氧呼吸:C6H12O62C2H5OH+2CO2+ATP,發(fā)酵的類型,按發(fā)酵原料來區(qū)分：糖類物質發(fā)酵、石油發(fā)酵及廢水發(fā)酵等類型。 按發(fā)酵產物來區(qū)分：如氨基酸發(fā)酵、有機酸發(fā)酵、抗生素發(fā)酵、酒精發(fā)酵、維生素發(fā)酵等。 按發(fā)酵形式來區(qū)分，則有：固態(tài)發(fā)酵和深層液體發(fā)酵。 按發(fā)酵工藝流程區(qū)分則有：分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵。 按發(fā)酵過程中對氧的不同需求來分，一般可分為：厭氧發(fā)酵和通風發(fā)酵兩大類型。,發(fā)酵工程在生物工程中的位置,基因工程細胞工程酶工程蛋白質工程發(fā)酵工程,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,代謝調控學是生物工程中的重要研究方向，是進行過程優(yōu)化的基礎。其內涵及研究深度也隨著生物技術的飛速發(fā)展而擴增，會派生出新的分支，如代謝工程等。只有深入研究微生物的內部調節(jié)規(guī)律和體內各種反應的啟動、中止、前后連接、耦合的次序及方式，充分了解微生物的代謝調節(jié)規(guī)律，掌握微生物生理和代謝的協(xié)調，才能打破其固有的遺傳守恒，充分表達其潛在的遺傳型。,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,世界上借助細胞培養(yǎng)的產品已占生物技術的40以上，達數(shù)百億元的產值。要提高生產水平，無不涉及到細胞代謝與及其調控的研究。由此生產的抗生素、氨基酸、維生素等在整個醫(yī)藥產品中占很大比例。,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,膜過濾發(fā)酵與分泌機制的研究都是圍繞如何除去對產物合成有害的代謝物，與避開終產物的反饋調節(jié)作用。膜過濾與發(fā)酵耦合成功地應用于解除對產物合成的不利作用，導致葡萄糖氧化酶的總產量提高2倍；利用超聲波等因素促進產物的分泌，使慶大霉素發(fā)酵單位提高1.7倍。,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,目前大量生物技術已從實驗室成果走向產業(yè)化，特別時基因工程藥物、疫苗、單克隆抗體等進入商品化階段，成為國民經(jīng)濟重要的支柱產業(yè)。由于生物過程特點表現(xiàn)在檢測參數(shù)的多樣性，相關耦合性，時變性，如果進一步與實驗室手工參數(shù)結合，就可對過程工藝進行深入分析。,過程優(yōu)化為目標的相關參數(shù)分析與控制,發(fā)酵是各種生化反應的綜合過程，只要某一因素成為限制條件，就會對生產產生嚴重影響。如何認識和發(fā)現(xiàn)這些限制因素就成為重要的研究課題。必須從物料或能量流的變化才能發(fā)現(xiàn)其中的本質。發(fā)酵過程調控與計算機在線傳感控制相結合，達到過程優(yōu)化。,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,我們在紅霉素發(fā)酵生產過程優(yōu)化研究中，把生物反應器的物料流與細胞內的代謝流結合起來，進而把發(fā)酵過程的生理調控研究與發(fā)酵過程優(yōu)化控制聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)了許多長期以來有經(jīng)驗總結但又無法進一步解釋的現(xiàn)象，在15L規(guī)模達到了發(fā)酵水平提高60以上的幅度。,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,在向生產規(guī)模放大時，提出了放大后的差異以參數(shù)相關理論從工藝上調整給補的方法，實現(xiàn)了從15L直接成功地放大到50M3規(guī)模。,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,在畢赤酵母表達重組人血清白蛋白時，研究了以甘油為基質的菌體生長階段和以甲醇誘導產物表達階段的物料流變化特性，進而解決了由于高密度培養(yǎng)所引起的供氧問題，在50L發(fā)酵罐規(guī)模從數(shù)百mg/L的水平提高了數(shù)十倍，并進一步放大到500L規(guī)模，避免了通純氧問題。最近在肌苷、鳥苷發(fā)酵研究方面又取得的突破，也是在這些理論指導下取得的。,微生物發(fā)酵代謝調控與發(fā)酵過程優(yōu)化技術,代謝調控是研究內在的調節(jié)機制，而過程優(yōu)化則是外在控制，是建立在相關參數(shù)的分析上的，這兩個方向相輔相成，前者為后者的基礎，而后者是使理論變?yōu)楝F(xiàn)實的手段。,The general layout of a biotechnical production process,二十一世紀的生命科學,Renewable raw materials,BiofuelsBiomaterialsChemicals,Cell Factory,Industrial biotechnology: Gateway to a more sustainable future,Figure1.Idealized biorefinery concept.(Image courtesy of Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA.),1 微生物生長與調節(jié),為了控制菌體的生長，需要了解生長的方式，細胞分裂和調節(jié)的規(guī)律，測量微生物生長的各種辦法，微生物生長繁殖的形式與工業(yè)生產的關系，環(huán)境變化對微生物生長的影響。因此，研究微生物的生長分化規(guī)律無疑是發(fā)酵調控原理的一個重要組成部分。,常用工業(yè)微生物郭美錦,一、細菌 （Bacteria）,概念：細菌是一類細胞細而短，結構簡單， 細胞壁堅韌，以二等分裂方式繁殖，水生性較強的原核微生物。分為：1球菌Coccus2桿菌Bacillus3螺旋菌Spirilla,細胞個體呈球形或橢圓形，不同種的球菌在細胞分 裂時會形成不同的空間排列方式，常被作為分類依據(jù)。0.51.0m 有單球菌、雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等。如金黃色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌、肺炎鏈球菌等。,1球菌Coccus,2桿菌（Bacillus ）,寬0.41.0m 長0.74.0m 常見有短桿狀、棒狀、梭狀、梭桿狀、月亮狀、分枝狀、竹節(jié)狀等。細胞呈桿狀或圓柱形，一般其粗細（直徑）比較穩(wěn)定，而長度則常因培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件不同而有較大變化。,芽孢桿菌B. subtilis,大腸桿菌 E.coli,Eg. 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌（綠膿桿 菌）、結核分枝桿菌、炭疽病的病原菌（炭疽桿菌）、 破傷風梭菌等。,細菌菌落形態(tài)（Clone Morphology),大腸桿菌菌落（E. coli Colonies grown on LB plates）,3螺旋菌Spirilla,有弧菌、螺旋菌、螺旋體菌等?；【鶹ibrio：菌體只有一個彎曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗號，鞭毛偏端生。如寄生性弧菌（蛭弧菌）、霍亂弧菌等。,二、細菌細胞結構,放線菌 Actinomyces,放線菌是一類呈絲狀生長，主要以孢子繁殖和陸生較強的原核生物。在形態(tài)上具有分枝狀菌絲、菌落形態(tài)與霉菌相似，以孢子進行繁殖?！敖橛诩毦c絲狀真菌之間又接近細菌的一類絲狀原核生物”；是抗生素的主要產生菌：Walksman 鏈霉素?？股兀ㄆ渲?0%由鏈霉菌產生）。,放線菌的形態(tài)構造 包括基內菌絲，氣生菌絲，孢子絲及孢子各部分組成。,S.rimosus colonies,Mycelium of Streptomyces in submerged culture,酵母狀真菌 -酵母（Yeast）,酵母菌（yeast）是一群單細胞的真核微生物。這個術語也是無分類學意義的普通名稱，通常用于以芽殖或裂殖來進行無性繁殖單細胞真菌，以與霉菌區(qū)分開。,啤酒酵母（Saccharomyces cerevisae）,個體形態(tài),卵圓、圓、圓柱、梨形等單細胞，其細胞直徑一般比細菌粗10倍左右。有的酵母菌子代細胞連在一起成為鏈狀，稱為假絲酵母,Pichia pastoris,絲狀真菌霉菌（Mold）,霉菌（mold）即發(fā)霉的真菌，通常指那些菌絲體比較發(fā)達而又不產生大型子實體的真菌。 應用：風味食品、酒精、抗生素（青霉素、灰黃霉素）、有機酸（檸檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等）、酶制劑（淀粉酶、果膠酶、纖維素酶等）、維生素、甾體激素等；飼料發(fā)酵、植物生長刺激素（赤霉素）、殺蟲農藥（白僵菌劑）,：,霉菌的形態(tài)結構,霉菌菌體均由分枝或不分枝的菌絲(hyphae)構成。許多菌絲交織在一起，稱為菌絲體(mycelium)。菌絲在光學顯微鏡下呈管狀，直徑約2-10微米，比一般細菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍，與酵母菌的相似。,根霉屬(Rhizopus)俗稱面包霉 孢子絲和孢子,無性孢子,曲霉,青霉孢子,金針菇,香菇,紅曲霉菌絲培養(yǎng)圖,Thanks for your listening!,細胞周期,對于個體細胞行為，主要關心染色體啟動、復制和分離新細胞壁材料的合成與插入?yún)f(xié)調染色體復制和細胞分裂的信號,細胞周期,細胞周期(Cell cycle)： 細胞的一系列可鑒別的周而復始的生長活動。這些活動的順序不變, 完成一個活動后才能進行下一個活動。,圖1 細胞周期,細胞周期,典型的真核生物細胞周期如圖所示: S, M和G1, G2分別代表DNA 合成, 有絲分裂期和兩次間隙。若生長速率因養(yǎng)分多寡而改變, S, G2 和M 幾乎不變, 只有G1改變。MTG: mean generation time,細胞周期,原核生物在低生長速率下的細胞周期, 與真核生物相似。其染色體復制期C 相當于 S；細胞分裂期 D相當于G2+M；C 和D 不隨生長速率變化, 只有G1可變動。細胞周期的各項活動怎樣去適應生長速率變化的需要？,染色體復制與細胞分裂的調節(jié),染色體復制怎樣與細胞分裂協(xié)調？ 在高速生長下, 如細胞周期為30 min, 染色體復制不能在一個周期內完成。為此，未等前一輪復制結束，后一輪復制又在原點上啟動?？梢园袰 期的啟動和終止,以及細胞分裂看作是不可更改的活動順序, 稱為C+D 周期。,染色體復制與細胞分裂的調節(jié),若增代時間少于 C+D時間, C+D 周期重疊，其重要特征是分配到子細胞的染色體已開始新的一輪復制。這類染色體稱為二叉染色體(dichotomous)。,圖2大腸桿菌的染色體復制和細胞分裂的時間分配示意圖,染色體復制和細胞分裂的調節(jié)規(guī)律,染色體復制未完成， 細胞就不會分裂。不管生長速率如何，大腸桿菌的細胞分裂總是出現(xiàn)在染色體復制完成之后。不管生長速率如何，C 和D 所需時間大致不變。C 和 D可以依次或同時(指上一輪的 D和下一輪的C ) 進行。,思考題,加倍時間最小為多少？C40， D20時，時間如何分配？,染色體復制的啟動,染色體復制的啟動受啟動因子(origin), 一種特異調節(jié)性蛋白的正向控制。當啟動因子增加到某一臨界水平, 啟動便開始。在這以后啟動因子被毀或稀釋。合成啟動因子達到有效濃度所需的時間恰好等于培養(yǎng)物增代時間。,染色體復制的啟動,大腸桿菌在啟動時的啟動因子數(shù)量與細胞質量之比在各種生長速率下是一樣的。這一比例實際上是染色體啟動因子的濃度。細胞似乎能檢出啟動因子的濃度。當它達到一臨界值時便啟動新一輪的復制。啟動的直接后果是啟動因子的濃度提高一倍。,染色體復制的啟動,啟動不會重新發(fā)生直到其濃度因生長而降到臨界值。這種控制機制構成一種生物鐘。它是以細胞體積或其它有關參數(shù)為依據(jù)。據(jù)此，染色體復制的啟動頻率是DNA 合成速率的控制步驟。,染色體復制的啟動,O/M=I 啟動， 啟動后，2O/M=I,II 不再啟動， M增加，M 2M，使I逐漸下降， 2O/2M=O/M=I，又開始啟動。,啟動和復制是性質截然不同的兩種過程,啟動的過程需要蛋白質合成，如蛋白質合成受阻，已啟動的DNA合成能完成，但不能啟動新一輪DNA合成 。曾檢出其產物負責啟動而不負責隨后復制的基因；加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白質合成或除去營養(yǎng)缺陷型所需的氨基酸都能阻止啟動，但允許復制繼續(xù)完成；培養(yǎng)物進入穩(wěn)定生長期后，中止生長的細胞含有完整的染色體。,染色體復制的啟動,啟動總是在染色體上的專一位置上進行。此位點稱為復制或染色體原點。在大腸桿菌此位點很靠近ilv座位。在大腸桿菌和枯草桿菌中復制叉以兩個方向沿染色體運行，大約在離原點180度地方相遇。,染色體復制的啟動,啟動的頻率取決于細胞量增長的速率，即生長停止，啟動也隨著停止是預料中的事。,細胞周期的研究方法,1 鏡檢法 用電子顯微鏡觀察單個細胞的生長，定時拍照。由此發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在分裂時細胞個子的變化不大。,細胞周期的研究方法,1 鏡檢法 說明似乎存在一種控制細胞個子大小的因子，即尺寸因子(size factor), 可能是啟動細胞質量(initiation mass)。,1 鏡檢法,缺點:細胞由培養(yǎng)液轉移到固體表面,會受到干擾。 細胞年齡變化較大時,細胞大小變化不大。,2 同步培養(yǎng)(Synchrony)法,(1) 密度梯度離心沉降法 按細胞的大小/年齡把在對數(shù)生長期的培養(yǎng)物分級。 H2O/D2O密度梯度沉降法: 能應用于任何品種, 不會施加滲透壓強 的影響。 從某一密度帶便可分離出同質的細胞群體，隨后培養(yǎng)。,細胞大小的分布頻率與蛋白質合成速率的關系,細胞大小的分布頻率與蛋白質合成速率的關系,蛋白質合成速率與細胞長度(體積)成正比，從而與細胞年齡成正比。,(2)過濾洗脫法,將細胞粘附在固體支持物，如硝化纖維膜上，然后將其倒置，讓生長培養(yǎng)基從上到下通過，新生的細胞便被洗脫到培養(yǎng)基中，呈一種特征性的振蕩模式，見圖123。,過濾洗脫法,(2)過濾洗脫法,在初始沖洗(wash-off)期后從濾膜上洗脫下來的主要是新分裂的細胞。在洗脫曲線高峰下從膜上洗下的細胞是沉積在膜上的新生細胞后代，那些在低峰下的是其沉積時正要分裂細胞后代。,過濾洗脫法,洗脫(wash- off)的振蕩模式可以測出細胞周期。,3 同位素示蹤法,如親本培養(yǎng)物沉積在濾膜上之前用氚標記的胸苷使細胞帶上標記，則結合到洗脫細胞的標記量與結合到親本培養(yǎng)物那一年齡細胞的標記量成正比。,細胞周期,細胞周期,其一個洗脫峰(后代)帶有比前一代少一倍的放射性標記。 可以分別求得C和D值,3 同位素示蹤法,另一種研究細胞周期的方法是通過蔗糖密度梯度離心，使一對數(shù)生長的培養(yǎng)物沉淀, 收集最上層的細胞，在含有氚-標記胸苷的生長培養(yǎng)基上生長，測量其DNA合成速率。,3 同位素示蹤法,洗脫前在無標記培養(yǎng)基中生長，洗脫時用帶標記的培養(yǎng)基，得到的帶標記DNA呈階梯上升狀。,細胞周期,4 生長速率與細胞個子大小的關系,生長培養(yǎng)基越豐富，細菌生長速率加快，其細胞的個子也越大。 如在同一種培養(yǎng)基內改變溫度也會影響生長速率，但對細胞個子大小幾乎沒有多大影響。,4 生長速率與細胞個子大小的關系,如一細胞的增代時間為60min，在細胞分裂時染色體復制便開始啟動。假設細胞這時具有質量為M (啟動細胞量=1/啟動因子濃度)。,4 生長速率與細胞個子大小的關系,個體細胞的量在指數(shù)地增加，直到2M，細胞便開始分裂。 此時從培養(yǎng)液中檢出新生的細胞，置于較豐富的培養(yǎng)基 (能使菌快速生長, 增代時間為35 min) 中，并假定細胞迅速調整到新的生長速率。,4 生長速率與細胞個子大小的關系,這樣，個體細胞量增長速率往上移動，如C+D規(guī)律還適用，下一個細胞分裂的時間不會變動，但細胞個子會增大。 新一輪復制的啟動將在細胞分裂前便開始。,4 生長速率與細胞個子大小的關系,換句話說，C+D 周期現(xiàn)在開始重疊?？焖偕L經(jīng)一個細胞周期后便達到新的平衡。生長速率越快，細胞個子的差異也越大。,生長速率對細胞個子和染色體復制啟動時間的影響,生長速率對細胞個子和染色體復制啟動時間的影響,可用式1-27 表示細胞周期t對指數(shù)培養(yǎng)物的細胞個子平均大小M 的影響。 M = K2(C+D/t) (1-27) 曲線的形狀將取決于C，D 和K 是否變，只有在簡單情況下logM與t作曲線才會得一直線。,細菌培養(yǎng)物的生長周期,在一來自靜止期細胞的培養(yǎng)物的生長期間，在細胞數(shù)目開始增加以前有一相當長的停滯期。細胞量開始增長的滯后現(xiàn)象短一些。,細菌培養(yǎng)物的生長周期,如達到物態(tài)的指數(shù)生長，則所有可測的參數(shù)也將平行地增長。當培養(yǎng)物進入靜止期便發(fā)生與上述相反的活動順序。因啟動速率比細胞分裂早減速CD分鐘。細胞量增長下降時，細胞分裂繼續(xù)指數(shù)進行，細胞漸漸變小。,細菌培養(yǎng)物的生長周期,細菌培養(yǎng)物的生長周期,新的一輪DNA復制的啟動頻率取決于新細胞量的積累速率，則吸光度與細胞數(shù)目至少有CD分鐘不平行。,生長速率和DNA濃度,細胞中的DNA%隨生長速率的增加而下降，可用式1-28表示:G/M=/(KC ln2)(1-2-C/) (1-28)式中G 是基因組的當量，為每個細胞的DNA 平均值。,生長速率對DNA濃度和平均染色體構型的影響,展示了3種質量倍增時間：a) 70 min，b) 40 min，c) 20 min,生長速率對DNA濃度和平均染色體構型的影響,一個啟動細胞量單位含有一個剛開始一輪復制的染色體。用一水平線C 分鐘長度表示。它在縱軸上所處高度代表細胞量。假定細胞量的復制時間為70 min，見圖1-28a，將出現(xiàn)輪與輪復制的間隙。當細胞量增加到三倍時它將完成4 個復制好的染色體。,生長速率對DNA濃度和平均染色體構型的影響,如在零小時把細胞置于增代時間為40 min的培養(yǎng)基內，見圖1-28b，則新一輪復制將緊跟在上一輪復制完成之后開始，輪與輪之間不存在間隙。待細胞量增到3個單位時，第二輪的復制將不會完成。結果得到2條復制了一半的染色體，DNA濃度下降到3/3。,生長速率對DNA濃度和平均染色體構型的影響,如將細胞置于增代時間為20 min的培養(yǎng)基內, 在第一輪復制還未完成前第二輪復制已開始。當細胞量達到3 時, 只有一個帶三個復制叉的染色體，見圖1-28c，DNA 濃度進一步下降到2.25/3。,生長速率對DNA濃度和平均染色體構型的影響,生長速率影響染色體上不同位置的相對基因拷貝數(shù),在一隨機的指數(shù)培養(yǎng)物中，接近原點處的基因，其拷貝數(shù)總是居多，靠近兩端的較少。 這種相對基因劑量的傾斜度隨生長速率的增加而提高。,生長速率影響染色體上不同位置的相對基因拷貝數(shù),DNA的濃度隨生長速率的增加而下跌，從而不同程度地影響基因濃度。那些靠近染色體原點的基因濃度沒有變化；位于中間的基因平均濃度則只有原點周圍的一半左右；處在染色體復制近末端的基因濃度最低。,生長速率影響染色體上不同位置的相對基因拷貝數(shù),在一個細胞周期內，一個基因濃度相對另一個而言，可相差4倍。生長速率對不同作用，提供了一種解釋非隨機基因次序的理由。,生長速率影響染色體上不同位置的相對基因拷貝數(shù),據(jù)此，對生長速率有限制作用的應位于靠近染色體原點處。其實，這是為什么大腸桿菌中有6 個拷貝編碼核糖體RNA的基因都聚集在原點的附近的緣故。,生長速率對細胞組分的影響,每個細胞RNA隨生長速率的變化可以達10倍之多。在快速生長的細胞中RNA的含量可以達到細胞重量的30。每個細胞的DNA也隨生長速率的提高而增加，但程度低一些。因此，以細胞重量衡量，DNA含量是減少的。細胞的外殼的厚度通常不變，胞壁和質膜在整個細胞中的比例隨細胞個子的增大而減小。,絲狀菌生長分化的調節(jié),微生物的生長調節(jié) 微生物的生長分化受其自身和外界多種因素的調節(jié)。這里以真菌為對象，闡述菌絲體形態(tài)調節(jié)的規(guī)律。,絲狀菌生長分化的調節(jié),霉菌和放線菌均為絲狀微生物。其生長方式是菌絲 (hyphae) 末梢伸長、分枝 (圖1-5) 和交錯成網(wǎng) (圖1-6)，稱為菌絲體 (mycelium)。一定長度的真菌菌絲，其橫切面有間隔膜。真菌屬真核生物，為多細胞，且每個細胞含有多個細胞核和各種細胞器。,絲狀菌生長分化的調節(jié),細胞一旦形成后便保持其完整性，且與其相鄰細胞的菌齡不同，越靠近末梢的菌絲，越年輕。 放線菌、鏈霉菌和諾卡氏菌屬均屬于放線菌屬，為原核生物，革蘭氏染色呈陽性。它們無核膜和細胞器，其菌絲直徑 (約1 m) 比霉菌 (2-10m) 細，易折斷。許多真菌能形成孢子，稱為分生孢子。,產黃青霉分散的菌絲體,放線菌菌絲體,放線菌菌絲體,Forms of morphology found in typical submerged cultures of filamentous fungi and actinomycetes,菌絲頂端生長(Apical growth of haphae),菌絲僅在頂端(末梢)生長, 其余部分的菌絲壁加厚，但不擴展。 居間生長(intercalary growth)的細胞的任何部分均能擴展與分裂。,菌絲頂端生長機制,大多數(shù)菌絲頂端生長機制都與泡囊(vesicles)在頂端的聚集有關。一旦生長停止，泡囊在頂端消失，并分布在次頂部生長區(qū)。,菌絲頂端生長機制,一種推測的細胞壁單位的生長活動,a) 含有細胞壁溶解酶的泡囊與質膜融合；b) 細胞壁的網(wǎng)狀結構局部拆開，從而取得塑性；c) 細胞壁由于原生質內部壓力而擴展，泡囊與質膜融合，釋放出細胞壁合成酶；d)新細胞壁的合成前體由泡囊提供，細胞壁的合成從質膜向外擴展；e) 新細胞壁單元被合成。,泡囊是什么?,泡囊是一種由單層膜包裹的細胞器, 可把它看作是溶酶體復合物或內膜復合物的一部分。 還含有細胞壁合成酶以及細胞壁的若干前體。它在胞內起運輸材料的作用。,泡囊如何在菌絲頂端聚集,內質網(wǎng)系統(tǒng)產生泡囊的區(qū)域位于菌絲的次頂部, 藉化學或電化學濃度梯度(推動力)移動的。菌絲頂端全靠發(fā)酵維持。因無線粒體，頂部以外的細胞靠線粒體進行正常呼吸。,泡囊如何在菌絲頂端聚集,用細胞松弛素(Cytochalasin)可以完全抑制細胞質的流動，從而阻止泡囊的移動和生長。故細胞質的流動是生長的推動力，使泡囊流向菌絲頂端。,泡囊如何在菌絲頂端聚集,如菌絲頂端同其次頂部區(qū)域被隔離, 則生長便緩慢下來； 如切斷的地方離開頂端遠些, 對生長的影響便小得多。 據(jù)此，可測定末稍生長區(qū)域的長度。粗糙鏈孢霉頂端生長的低限長度為10 mm。,兩種形式的胞質流動,一種是導向菌絲頂端的快速流動。菌絲頂端失水, 造成頂端與次頂端之間的水勢梯度，從而加速這種流動。 另一種形式的胞質流動為雙向流動或環(huán)流 (Cyclosis) , 其流動速率要慢得多。,泡囊的形成,泡囊的形成是由高爾基(Golgi)體或內質網(wǎng)(Endoplasmic reticulum) 的特定區(qū)域釋放，再輸送到生長點，與質膜結合。,泡囊的三種作用,1) 運輸各種負責把細胞壁拆開和擴建的酶； 2) 運輸新的細胞壁成分, 其前體或預制單位； 3) 運輸合成。,菌絲生長過程,對孢子發(fā)芽的研究可獲得有關頂端生長的有用的信息。 如圖所示, 開始孢子吸水膨脹, 這時細胞壁合成材料散布在孢子周圍內表面, 隨后長出芽管，新材料便聚結在芽管的頂端。,菌絲生長過程,故極性生長并不是一開始就有的特性，而是在非極性(各向同性)生長過后才出現(xiàn)的。在不利條件下有些真菌的極性生長(非各向同性)被無限地推遲。,菌絲生長過程,黑曲霉的孢子在44下生長，它繼續(xù)膨脹，形成巨細胞。如這時再轉移到30下生長，它會表現(xiàn)得很特殊。從巨細胞中伸出芽管，隨后形成孢子，見圖1-37。,菌絲生長過程,菌絲生長過程,這說明在孢子膨脹期間黑曲霉也能正常地成熟，甚至產生孢子，只是要等到適合于極性生長時機才能表達這種潛在能力。,菌絲頂端生長過程,研究頂端生長過程的另一種實驗方法是用水浸沒鐮刀菌菌落，觀察其頂端生長情況。,菌絲頂端生長過程,菌絲頂端生長過程,結果有半數(shù)菌絲末梢停滯1 分鐘后重新生長，只是在膨脹的菌絲頂端長出較細的菌絲。其余菌絲停止生長幾分鐘后在菌絲頂端又長出一個以上的較細的芽。,菌絲頂端生長過程,重復以上試驗，但這次加水后,等40秒，再加入等滲溶液(即與瓊脂的滲透壓一樣的溶液)。這會使它膨脹，暫停出芽。過后又長出一個以上的細芽。,菌絲頂端生長過程,這些現(xiàn)象說明，生長可能包含兩個過程:1) 塑性頂端的延伸：2) 細胞壁的硬化，即隨頂端延伸后的硬化。,菌絲頂端生長過程,在正常生長情況下這兩個過程以同樣的速率進行，只是硬化緊隨頂端延伸之后，故總是只有一小段延伸區(qū)域呈塑性。,菌絲頂端生長過程,菌絲浸水試驗的第一種情況可解釋為浸水后生長延伸停止，菌絲頂端在重新調整其新的滲透壓期間，細胞壁的硬化繼續(xù)進行，在頂端還未完全封住前，在剩下的還未硬化的當中塑性部位繼續(xù)長出一細芽；,菌絲頂端生長過程,對第二種情況，生長再次受到干擾，耽誤了在剩余部位出芽的時機，最終頂端全被封住。這期間胞質繼續(xù)流動的結果菌絲頂端膨脹，過幾分鐘便會在其它薄弱部位找到突破口，抽出一個以上完全新的細芽。,菌絲頂端生長過程,細胞壁的硬化是指胞壁的加厚或完全新的細胞壁的沉著, 而塑性頂端的延伸要靠溶解酶類的作用才能實現(xiàn)。 因此，如這些酶不穩(wěn)定，或被蛋白酶降解，或因滲透壓改變，阻止泡囊與菌絲頂端的結合，結果便出現(xiàn)胞壁的硬化。,菌絲分枝規(guī)律,菌絲分枝一般離生長著的菌絲頂端有些距離的后方進行。真菌如同高等植物那樣顯示出頂端生長的優(yōu)勢。但怎樣維持這種優(yōu)勢知道的很少。,菌絲分枝規(guī)律,菌絲分枝一般均朝向菌落的邊緣擴展生長， 并偏離其親本菌絲和相互岔開生長。,菌絲分枝規(guī)律,這是多余的細胞質用于生長的結果，并且在細胞質體積，核分裂和分枝數(shù)目之間存在著明顯的關系。在其它真菌中也確定了細胞體積和分枝之間的類似關系。,分枝的形成,分枝需要從已成熟的細胞中產生。這伴隨著泡囊在菌絲頂端的聚集。分枝在菌絲的哪一部位產生? 這似乎有一中意點, 往往位于間隔的附近。通過試驗可證實這一點。,完整菌絲斷片的出芽位置,Figure 3. Integrated model for the formation of aerial hyphae in the filamentous bacterium Streptomyces coelicolor. (a) Extracellular signalling and environmental signals exert the Ir influence on development through the bld cascade. This cascade induces the formation of Ram R, the chaplins ChpE and ChpH(redcircles), and components of the sky pathway, such as a sensor of aerial growth (bluecircles). Ram R activates the synthesis of RamS, which is converted to SapB (yellowcircles). This morphogenetic peptide is secreted by the RamA B transporter purpleovals) and, together with ChpE and ChpH, initiates aerial growth by lowering the water surface tension. (b) From this moment, the sky pathway takes over regulation of development. This pathway would include a sensor of aerial growth (bluecircles). As a consequence,the rodlin and chaplin genes, and probably other genes, are activated. Rodlins (green circles) and chaplins (red circles) assemble into ahydrophobic rodlet coat at the outer surface of aerial hyphae.This layer provides surface hydrophobicity and prevents aggregation of aerial hyphae. The insert shows the typical appearance of the rodlet layer, as assessed by scanning electron microscopy.,分枝的形成,將菌絲打碎，只要得到含有完整間室的碎片，便能如圖1-39 那樣產生新的分枝。新分枝總是產生在這些碎片的靠間隔處，故即使在菌絲內其個體細胞也有某些程度的極性。,菌絲生長單位(hyphal growth unit) G(=m),G 菌絲總長度/菌絲分枝數(shù)目 經(jīng)最初的波動后G隨菌落的生長而變化。因此，分枝的數(shù)目總是與菌絲總長，從而與細胞質的體積成正比。 由此可見，新分枝是在胞液體積超過現(xiàn)有分枝數(shù)所能容納的體積時產生的。,菌絲生長單位,在瓊脂中生長的不同階段攝下年輕菌落的發(fā)育照片，按公式可求的菌絲生長單位（G）,菌絲生長單位,從生長單位的確立可看出胞液體積與分枝之間有如下規(guī)律：1) 每一分枝連同其有關的一定量的細胞質可當作一個菌絲單位(unit)，就像對待個體細胞，如酵母那樣。故一真菌菌落是靠假想的單位生長的。實際上它們是連在一起，分不清的；2) 由于新的分枝是多余細胞質形成的，分枝的數(shù)目基本上取決于菌落的營養(yǎng)狀況，從而取決于細胞質的數(shù)量；,菌絲生長單位,3) 因現(xiàn)有的分枝能優(yōu)先得到細胞質，故一分枝的形成對已有的分枝的生長速率影響很??；4) 真菌菌落容易適應一定范圍的養(yǎng)分濃度變化。它在養(yǎng)分貧乏的瓊脂培養(yǎng)基中散開的速度幾乎同豐富培養(yǎng)基上的一樣，但分枝少一些。,菌絲生長單位,菌絲生長單位,生長初期，菌絲總長度和分枝數(shù)目均以指數(shù)的速率增加，這時的菌絲體間隔較長。菌絲生長單位的變化幅度隨生長而減小，最后穩(wěn)定。,微生物生長分化的調節(jié),微生物的生長分化受其自身和外界多種因素的調節(jié)。以真菌為對象闡述菌絲體形態(tài)的調節(jié)。以下的規(guī)律主要適用于固體培養(yǎng)基上生長的未分化菌絲。,微生物生長分化的調節(jié),真菌孢子在培養(yǎng)基上發(fā)芽，形成未分化的菌絲，繼續(xù)生長，分化為成熟的菌絲。,微生物生長分化的調節(jié),絲狀菌的形態(tài)上的優(yōu)勢:菌能無限擴增而無需改變細胞質的體積與表面積之比；菌絲體與培養(yǎng)基之間的物質交換只需通過較短的距離；菌絲以有規(guī)律的分枝確保它能高效地復蓋在固體培養(yǎng)基上。,微生物生長分化的調節(jié),微生物生長分化的調節(jié),未分化菌絲的生長調節(jié)至少包含三種機制,1)菌絲極化的調節(jié) 生長是極化的, 菌絲的伸長僅限于菌絲頂端；2)分枝啟動的調節(jié) 芽管伸長，形成主桿菌絲, 并由此形成初級分枝, 再由此形成次級, 一直分枝下去。從菌絲體的形態(tài)特征說明存在著一種調節(jié)分枝啟動頻率的機制；3)菌絲空間分布的調節(jié) 未分化菌絲趨向于分散獨立生長，相鄰菌絲間的接觸因 回避作用 而減少。這稱為向自性 (autotropism)。,極化生長的調節(jié),菌絲極化生長是指孢子或菌絲細胞的一端發(fā)芽，伸長，長成菌絲。培養(yǎng)條件，如溫度不適，或在厭氧，含CO2濃度較高的條件下會阻止極化生長，并以非極化(即各向同性)方式, 像酵母那樣生長。非極化生長是與不利的生長條件相聯(lián)系的。,極化生長的調節(jié),菌絲極化生長受若干內源調節(jié)機制的控制。菌絲生長(孢子發(fā)芽，頂端生長，分枝)總是與泡囊的活動相聯(lián)系。 調節(jié)是通過向菌絲頂端輸送泡囊，泡囊與細胞膜融合發(fā)揮作用的。 擾亂這兩種作用會導致各向同性生長。,菌絲分枝啟動的調節(jié),從孢子發(fā)芽后未分化菌絲體起先在大致恒定的環(huán)境條件下生長，隨后其生長環(huán)境，即培養(yǎng)基的物化條件有較大的改變。在固體培養(yǎng)基上菌絲體的初期生長階段與分批培養(yǎng)的初期指數(shù)生長條件相似，所形成的菌絲也基本相同。以下的分枝啟動規(guī)律除特別注明外均指未分化菌絲。,微生物生長分化的調節(jié),菌絲平均伸長速率(E) E=2(Ht-H0) / (BtB0) = G (1-36)Ho和Ht分別為零和1 h的菌絲體的總長度； Bo和Bt分別為零和1 h的分枝數(shù)目。G 為菌絲生長單位；為比生長速率。在標準的培養(yǎng)基中測定不同霉菌的E，其標準偏差不超過12%。,微生物生長分化的調節(jié),E是未分化菌絲的分類特征，見表1-22。 未分化菌絲體的總長度起初以指數(shù)速率增長，直到菌絲體總長超過15 mm (以凍土毛霉為例)為止。 接下去是生長速率的累進期。,微生物生長分化的調節(jié),指數(shù)期的長短通常受霉菌菌絲生長單位的影響，如形成稠厚菌絲體的產黃青霉(G =48m) 比形成稀疏菌絲體的凍土毛霉(G = 95m)減速早一些。 這大概與培養(yǎng)基成分的不利變化，如pH，次級代謝物或養(yǎng)分濃度的變化，和菌絲體的分化有關。,微生物生長分化的調節(jié),環(huán)境條件對菌絲生長單位（G）的影響,a 溫度 菌絲生長單位不受溫度的影響，和E均隨溫度的改變而以相同的速率變化，即E/為一常數(shù)。故溫度影響菌絲生長單位的復制速率，而不是長度。,環(huán)境條件對菌絲生長單位的影響,b 培養(yǎng)基成分 營養(yǎng)成分的改變會影響G和，但對E的作用不大，從表1-23可見，不同培養(yǎng)基對的影響恰好與對G的影響相反。,環(huán)境條件對菌絲生長單位的影響,環(huán)境條件對菌絲生長單位的影響,c 分枝誘導劑 L-山梨糖抑制粗糙鏈孢霉的E，對影響不大，因而使G下降，誘導粗糙鏈孢霉茂盛分枝。用L-山梨糖處理過的的菌絲體，其max保持不變，但其空間分布改變，霉菌以群生(成團)或半群生方式生長。,環(huán)境條件對菌絲生長單位的影響,d 抑制劑 霉菌生長抑制劑對G的影響取決于抑制劑的性質和劑量，如G不受影響，說明這種抑制劑同時影響E和，因而G = E /不變。 環(huán)己酰胺則會使G減小。,菌絲空間分布的調節(jié),菌絲傾向于散開單獨生長，部分原因是向自性(autotropism)的結果。向自性是一種確保同類菌絲高效地覆蓋固體培養(yǎng)基的機制。,菌絲空間分布的調節(jié),對這種現(xiàn)象有兩種解釋：1)菌對聚集于環(huán)境中的未知因素的負向化性反應； 2)對氧或其它營養(yǎng)要素的正向化性反應。 所謂向(趨)化性是指一種以化學物質為刺激源的向性，負則表示避開的意思。,二、微生物生長環(huán)境（Environment of Microorganism Growth）環(huán)境因子：溫度(Temperature)、 酸堿度（pH）、 滲透壓、 水的活度(Activity of water)、 壓力(Pressure)等,(h-1) 嗜冷菌 中溫菌 嗜熱菌 026 1543 3765 T()從上圖可知：（1）任何微生物生長溫度范圍都小于30；,（一）、溫度對生長的影響,（2）生長速率隨溫度的升高而緩慢增加，直到達到最高的生長速率；(3)超過此值時生長速率隨溫度的進一步提高而訊速下降。(4)溫度與生長的關系符合Arrhenius方程： When Growth: Specific Growth Rate =Ae- Ea/RT When Death: Specific Death Rate =Ae Ea/RT (where Ea=1530Kcal/Mol, Ea=6090Kcal/Mol ) Growth Modelling: dX/dT=X-X,問題（Questions）:1.如何解釋最適生長溫度與最適產物形成不一致？ 2.如何解釋獲得最大比生長速率（max）溫度與獲得最大菌體得率系(Yx/s)數(shù)溫度不一致？,（二）pH對生長的影響 (h-1) pH 圖 pH與微生物生長關系圖Fig. Relationship of pH and Cell growth由上圖可知：（1）微生物生長一般的pH范圍為36，不超過8.5； （2）最大生長速率時的pH變化范圍為0.51；從上二圖可知pH與最適溫度之間關系：生長最適溫度高的菌種，其最適pH也高。,參數(shù)變化： pH上升超過最適值，表示細胞處饑餓狀態(tài)，需補加碳源，補糖過量又會下降；pH控制策略：（1）補氨水，但過量氨水會使菌體中毒，引起呼吸速率急速下降，即CER下降； （2）控制補碳源速率,pH動態(tài)變化,溶氧（DO）,（a）氣泛狀態(tài)（b）氣載狀態(tài)（c）完全分散態(tài),氣 體,C*P/H, 與氣相中氧分壓相平衡的液體中氧的濃度 H:亨利系數(shù),Kl: 以氧濃度為推動力的總傳遞系數(shù) (m/h),再令：單位體積的液體中所具有的氧的傳遞面積為 a (m2/m3),Nv：體積傳氧速率 kmol/m3.hKla: 以(C*-C)為推動力的體積溶氧系數(shù) h-1,二、發(fā)酵液中氧的平衡,發(fā)酵液中供氧和需氧始終處于一個動態(tài)的平衡中,傳遞(OTR)：,消耗(OUR)：,OUR= QO2 .X,氧的平衡最終反映在發(fā)酵液中氧的濃度(DO)上面 DO = OTR- OUR,Oxygen trnsfer rate, OTR,OUR與氧傳遞,菌體與氧傳遞,氧傳遞,氧傳遞,氧傳遞= f( T R P F 菌體形態(tài) 親和常數(shù) 代謝活性),徐慶陽等 微生物學通報，2007,5%,20%50%70%,谷 氨 酸 發(fā) 酵,產酸 轉化率標準(40-50) 122.0 63.7%低 (20左右） 115.2 57.0%,徐凱等，中國調味品，2007,郜培等，食品工業(yè)發(fā)酵，2005,郜培等，食品工業(yè)發(fā)酵，2005,GLU,OD,a-KG,過程分析,（三）滲透壓對生長的影響 根據(jù)耐受鹽濃度的大小可將微生物分為四類： A. 非嗜鹽菌 0-1.0g/L; B海洋細菌 0.15.0g/L; C. 中等嗜鹽細菌 2.3-20.5g/L; D. 極端嗜鹽菌 12-36g/L(飽和),一般耐滲透性越強的細菌細胞內與胞外K+濃度之比越大，例如：1. E.coli K+吸收能力增加，細胞內滲透壓亦增加，這了維持大致恒定的離子強度，于是排出腐胺，2.甘油發(fā)酵，則利用耐高滲透壓酵母進行，代謝途徑為： 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 1,6-二磷酸果糖 戊糖途徑（HMP Pathway） 丙酮酸 磷酸二羥丙酮 TCA 厭氧CO2 乙醇 甘 油 多 醇 圖 甘油代謝示意圖（Glycerol Metabolic Pathways）,阿卡波糖由游動放線菌(Actinoplanes sp .SE 50)產生。對腸道內的蔗糖酶、麥芽糖酶、糊精酶和葡萄糖淀粉酶都有強烈的抑制作用，并對a一淀粉酶有微弱的抑制作用。,aC7N單位 b4,6-二脫氧己糖,c麥芽糖,阿卡波糖由阿卡波糖特征基團acarviose和麥芽糖組成，acarviose由雙脫氧葡萄糖和有效霉胺（即不飽和氨基環(huán)醇C7N結構）兩部分組成。,氨基環(huán)醇（a組分）來自于磷酸戊糖途徑中的7磷酸景天庚酮糖,轉化酶由abcC、M、O、R編碼。其中