微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義.doc

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)微生物（2008級(jí)基地班）任課教師： 熊 芳教學(xué)時(shí)數(shù)： 15學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)周數(shù)： 4周 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心微生物實(shí)驗(yàn)?zāi)夸洠?5學(xué)時(shí)）微生物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)介紹實(shí)驗(yàn)一：培養(yǎng)基的配制與滅菌（4學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)二：土壤自生固氮菌的分離純化（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)三：顯微鏡的使用和簡單染色（3學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)四：革蘭氏染色和莢膜染色（3學(xué)時(shí)）第一次實(shí)驗(yàn)：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉實(shí)驗(yàn)室規(guī)則和安全守則，正確應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的意外事故；2.認(rèn)識(shí)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器和有關(guān)試劑的基本知識(shí)；3.掌握實(shí)驗(yàn)報(bào)告的正確書寫。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則；2.實(shí)驗(yàn)室安全守則；3.實(shí)驗(yàn)室中意外事故處理；4.常用器皿及用具；5.顯微鏡及有關(guān)知識(shí)；6.實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)、實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制和高壓蒸汽滅菌配置培養(yǎng)基的基本流程如下：原料稱量溶解調(diào)節(jié)pH值過濾澄清分裝塞硅膠塞和包扎滅菌培養(yǎng)基的配制原則一、營養(yǎng)成分1. 根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基，如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應(yīng)該）由簡單的無機(jī)物質(zhì)組成。異養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機(jī)物質(zhì)。碳源物質(zhì)的功能：構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)；為機(jī)體提供整個(gè)生理活動(dòng)所需要的能量（異養(yǎng)微生物）。氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物營養(yǎng)所需的氮元素的營養(yǎng)源，稱為氮源。氮源物質(zhì)的主要作用是合成細(xì)胞物質(zhì)中含氮物質(zhì)，少數(shù)自養(yǎng)細(xì)菌能利用銨鹽、硝酸鹽作為機(jī)體生長的氮源與能源，某些厭氧細(xì)菌在厭氧與糖類物質(zhì)缺乏的條件下，也可以利用氨基酸作為能源物質(zhì)。能源 指能為微生物的生命活動(dòng)提供最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能。2. 注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度與配比 營養(yǎng)物的濃度：在一般情況下，濃度合適的營養(yǎng)物質(zhì)才對(duì)微生物表現(xiàn)出良好作用，濃度大時(shí)對(duì)微生物生長起抑制作用，濃度小時(shí)不能滿足微生物生長的需要。 各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度比：培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度比直接影響微生物的生長與繁殖和（或）代謝產(chǎn)物的形成與積累，尤其是碳氮比（CN）（碳氮比一般指培養(yǎng)基中元素碳與元素氮的比值，有時(shí)也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白兩種成分含量之比）的影響更為明顯。二、控制培養(yǎng)基的PH值 各類微生物生長的最適pH各不相同，細(xì)菌與放線菌生長的pH在7-7.5之間，酵母菌與霉菌生長的pH值在4-5之間。 在微生物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，常會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對(duì)恒定，通常采用下列兩種方式：內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要流加酸或堿液三、滲透壓注意營養(yǎng)物質(zhì)要有適合的濃度，不能太低滿足不了生長的需要，太高則滲透壓太大，也會(huì)抑制微生物的生長四、氧化還原電位氧化還原電位越高，培養(yǎng)基的氧化活動(dòng)越強(qiáng)，在厭氧菌培養(yǎng)中，加入還原劑，可降低自由氧的毒害。培養(yǎng)基的種類據(jù)組成成分可分為:1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。是一類按微生物的營養(yǎng)要求精確設(shè)計(jì)后用多種高純化學(xué)試劑配制成的培養(yǎng)基。如葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基、淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基等。2.半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。例如，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。 3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機(jī)物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑（常用凝固劑為瓊脂）的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入1-2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。 3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.20.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。按照培養(yǎng)基的用途，可將其分為1.加富培養(yǎng)基：加富培養(yǎng)基是指在普通培養(yǎng)基里加過血、血清、動(dòng)物（或植物）組織液或其他營養(yǎng)物質(zhì)（或生長因子）的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)某種或某類營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物。2.選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基是根據(jù)某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要或?qū)δ撤N化合物的敏感性不同而設(shè)計(jì)出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。3.鑒別培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)的指示劑或化學(xué)藥品，從而產(chǎn)生某種明顯的特征性變化，以區(qū)別不同的微生物。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備一、 實(shí)驗(yàn)原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供作微生物生長繁殖之用?；A(chǔ)培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量的瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下96時(shí)溶化，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，一般在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH值調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000mlpH 7.47.6。二、 實(shí)驗(yàn)器材1、 溶液和試劑 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。2、 儀器或其他用具 試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0），棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩/皮筋，紗布等。三、 操作步驟1、 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。蛋白胨很易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。2、 溶化：在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱，或在磁力攪拌器上加熱溶解。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需要的總體積，如果配置固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。在制備用三角瓶盛固體培養(yǎng)基時(shí)，一般也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，然后按1.5%2.0%的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱溶化同時(shí)進(jìn)行，節(jié)省時(shí)間。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)，需不斷地?cái)嚢瑁苑拉傊嗪谉?。配制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中。3、 調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測其pH，直至pH達(dá)7.6。反之，用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。pH不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配置pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解而不能凝固。4、過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。5、分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶中。（1） 液體分裝 分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。（2） 固體分裝 分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的量以不超過三角瓶容積的一半為宜。（3） 半固體分裝 試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。6、 加塞 a) 包扎：加塞后，將全部試管用麻繩/皮筋捆好，再外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕塞，其外再用一道麻繩/皮筋扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配置日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配置日期。（有條件的實(shí)驗(yàn)室，可用市售的鋁箔代替牛皮紙，省去用繩扎，而且效果好。）b) 滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.103Mpa,121，20min高壓蒸氣滅菌。c) 擱置斜面：將滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50左右（以防斜面上冷凝水太多），將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。d) 無菌檢查：將滅菌培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2428h，以檢查滅菌是否徹底。阿斯畢無氮培養(yǎng)基甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3 5g瓊脂 20g水 1000mlPH 7.07.2 121 滅菌30分鐘高壓蒸汽滅菌一、目的要求1了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。2學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出226kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。實(shí)驗(yàn)室中常用的高壓蒸汽滅菌鍋有立式、臥式和手提式等幾種，其構(gòu)造如圖。本實(shí)驗(yàn)介紹手提式和立式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。三、器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，阿斯畢無氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿，立式高壓蒸汽菌鍋等。四、操作步驟1首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。2放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用 105kg/cm2，1213，20分鐘滅菌。5滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。6將取出的滅菌培養(yǎng)基放入 37溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1結(jié)果檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。2思考題（1）高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么要待壓力降到0時(shí)才能打開排氣閥，開蓋取物？（2）在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，怎樣杜絕一切不安全的因素？第二次實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)二 土壤自生固氮菌的分離和純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)微生物的純系分離、培養(yǎng)方法；2、掌握稀釋分離、劃線分離、涂抹分離純化微生物的方法。二、基本原理： 為了生產(chǎn)和科學(xué)的需要，往往需要從自然界混雜的微生物群中分離單一的菌種，這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物分離。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，可采用下列兩種方法：一種是提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。如要從土壤中分離自生固氮菌，則培養(yǎng)基中是不能含有N源，這種培養(yǎng)基就比較適合能利用空氣中N2的微生物。另一種方法是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制人們不需要的微生物的生長繁殖。分離土壤中的真菌，往往在分離真菌的馬丁培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)拿霞永t、鏈霉素和金霉素等化學(xué)藥品，目的在于抑制細(xì)菌的生長，這樣更有利于獲得純培養(yǎng)。土壤中微生物數(shù)量眾多，在肥沃土壤中固氮菌數(shù)量也很多，自然界中多數(shù)氮素養(yǎng)料是有微生物固氮的結(jié)果，固氮菌一般可分為自生固氮菌和共生固氮菌兩類。要分離自生固氮菌，常用阿斯畢無氮培養(yǎng)基這種選擇性培養(yǎng)基，控制其適宜的環(huán)境條件，使它在培養(yǎng)基上大量繁殖，然后通過稀釋法或劃線分離法，使它在培養(yǎng)基上形成單菌落，若分離得不純，需要進(jìn)一步純化，直到得到純種。三、 實(shí)驗(yàn)材料1、 培養(yǎng)基：阿斯畢（Ashby）無氮培養(yǎng)基2、 菜園土3、 滅菌培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、接種針、酒精燈等。四、 方法與步驟：（一） 富集培養(yǎng)：（第二次實(shí)驗(yàn)做）1、 用已滅菌后冷卻至50左右的阿斯畢培養(yǎng)基倒平板。2、 用已滅菌的鑷子將黃豆粒大的菜園土擺入已冷凝的平板培養(yǎng)基上。3、 正面放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28培養(yǎng)3-4天后，在土粒周圍有渾濁半透明的膠狀菌落出現(xiàn)，有的在后期會(huì)產(chǎn)生褐色的色素。（二） 劃線分離純化：（第三次實(shí)驗(yàn)做）1、 用已溶化至50的阿斯畢培養(yǎng)基倒平板；2、 用接種環(huán)挑取上述菌落少許，在冷凝平板上進(jìn)行劃線分離，而后置于28培養(yǎng)4天。劃線方法如圖： A:交叉劃線法（1、2、3、4為依次劃線的起點(diǎn)）B：連續(xù)劃線法（1、2為依次劃線的起點(diǎn)）（三） 純化、鏡檢，得到純種培養(yǎng)（第四次實(shí)驗(yàn)做）1、平板上出現(xiàn)單菌落，按無菌操作移入阿斯畢培養(yǎng)基斜面試管中，28培養(yǎng)4天，即獲得純培養(yǎng)菌，可冷凍保存，備用；（要求每人至少保存自生固氮菌的一支斜面試管，并貼好標(biāo)簽。）2、鏡檢：將斜面菌株進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。如是粗短桿狀或球狀的單一形態(tài)的菌體細(xì)胞較大，常呈單個(gè)或“8”字排列，在細(xì)胞表面有較厚的莢膜者，即為自生固氮菌。若有雜菌，需要進(jìn)一步劃線純化。注意事項(xiàng)：1） 微生物分離、純化這一操作環(huán)節(jié)，要嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行。2） 平板劃線時(shí)，劃線部位不可重疊；3） 劃線時(shí)，每次都要將接種環(huán)上多余菌體燒掉。第四次實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)三 顯微鏡的使用（詳見細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)）和細(xì)菌的簡單染色法一、目的與要求：1學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。 2掌握細(xì)菌的簡單染色法。 3初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征，鞏固學(xué)習(xí)油鏡的使用方法和無菌操作技術(shù)。 二、原理： 細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。微生物的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色。利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。 常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，這是因?yàn)樵谥行?、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。 當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。 染色前必須固定細(xì)菌。其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。 三、材料 1菌種：大腸桿菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2染色劑：石炭酸復(fù)紅染液或草酸銨結(jié)晶紫染液。 3儀器或其他用具 顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，玻片擱架、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。 四、流程 涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢。五、 步驟 1涂片 ：取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸溜水)于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作，分別從大腸桿菌和金黃色葡萄球菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液(或液體培養(yǎng)物)涂片，可用接種環(huán)挑取23環(huán)直接涂于載玻片上。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時(shí)不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。 2干燥：室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太近，因溫度太高會(huì)破壞菌體形態(tài)。 3固定：如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，方法同干燥。涂片、干燥和熱固定。 4染色：將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液12滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍(lán)染色12min，石炭酸復(fù)紅(或草酸銨結(jié)晶紫)染色約1min。 5水洗： 傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。水洗時(shí)，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。 6干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。 7鏡檢：涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。 六 結(jié)果 ： 繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態(tài)圖。實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的革蘭氏染色和莢膜染色革蘭氏（Gram,s）染色法一、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)上一種重要的鑒別染色法。用這種染色法可以把細(xì)菌分為兩大類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。該法所用的染料是用兩種不同性質(zhì)的染料草酸銨結(jié)晶紫和番紅染液。細(xì)菌先用草酸銨結(jié)晶紫進(jìn)行初染，經(jīng)碘液媒染后，再用95乙醇（或丙酮乙醇）脫色，最后用番紅復(fù)染。如細(xì)菌保持草酸銨結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的顏色而不被乙醇脫色，則細(xì)菌呈紫色，稱為革蘭氏陽性菌，該反應(yīng)稱為革蘭氏陽性或正反應(yīng)（用G+表示）；如細(xì)菌能被乙醇脫色而又能被番紅染成紅色的稱為革蘭氏陰性菌，其反應(yīng)則稱為革蘭氏陰性或負(fù)反應(yīng)（G-表示）。革蘭氏染色反應(yīng)的機(jī)理，初染時(shí),在細(xì)胞膜內(nèi)形成草酸銨結(jié)晶紫與碘復(fù)合物, G+細(xì)胞壁厚,肽聚糖網(wǎng)層次多和交聯(lián)致密, 95乙醇（或丙酮乙醇）處理時(shí),使網(wǎng)孔縮小,再加上它不含類脂.故乙醇處理后復(fù)合物不會(huì)溶出縫隙.反之, G-細(xì)胞壁薄,外膜層的類脂含量高, 肽聚糖網(wǎng)層次多和交聯(lián)差,以類脂為主的外膜溶解,薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋復(fù)合物的溶出.主要是由于兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同，因而對(duì)結(jié)晶紫碘復(fù)合物的滲透性不同，導(dǎo)致了不同染色反應(yīng)。芽孢桿菌和絕大多數(shù)球菌（以及所有的放線菌和酵母菌）都呈革蘭氏陽性反應(yīng)，而大多數(shù)無芽孢桿菌弧菌螺旋菌和某些球菌則呈革蘭氏陰性反應(yīng)。因此，革蘭氏染色法在細(xì)菌的分類鑒定和生產(chǎn)應(yīng)用上具有重要意義。有些特殊的細(xì)菌，革蘭氏染色反應(yīng)不穩(wěn)定，稱為革蘭氏不定細(xì)菌（Gram variable bacteria）。二、實(shí)驗(yàn)材料1第二周分離得到的微生物;2培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌（E.coli），金黃色葡萄球菌;3載玻片接種環(huán)酒精燈及火柴赫克爾（Hucker）氏結(jié)晶紫染色液路戈（Lugol）氏碘液95乙醇番紅染色液吸水紙顯微鏡。三、操作步驟（一）涂片1混合涂片法：取一潔凈載玻片，滴一小滴蒸餾水于玻片中央。按無菌操作要求，先用接種環(huán)挑取少量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物于玻片中央水滴中，涂布均勻。接種環(huán)經(jīng)灼燒滅菌冷卻后，再挑取少量大腸桿菌培養(yǎng)物，混涂于玻片中央枯草芽孢桿菌菌液中，制成混合涂片。要求涂片薄而均勻。2三區(qū)涂片法：在一潔凈載玻片近兩端各滴一小滴蒸餾水，按無菌操作要求，先用接種環(huán)取少量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)