神經(jīng)肌肉組織活檢常用方法和步驟.docx

肌肉活檢樣品取材和送檢注意事項一般原則1. 通常使用活組織切開檢查法獲取肌肉組織。2. 對于具有不協(xié)調(diào)病理學(xué)功能障礙患者，切開活組織檢查非常必要，例如多發(fā)性肌炎。3. 燒傷、縫合或磁夾部位的肌肉組織不能取樣送檢。4. 細(xì)針穿刺肌肉組織活檢可以減少病人的損傷，但也可能會取樣不全，丟失肌肉斑片或肌外膜組織。5. 盡可能在同一活檢取材位置獲取數(shù)個肌肉樣品，特別是對于多病灶疾病，炎性肌病，需要做代謝分析的肌病可疑患者。肌肉樣品送檢1. 肌肉樣品在濕鹽水紗布中可保存幾個小時，注意肌肉不應(yīng)該浸在鹽水、固定劑或其他液體中，同時樣品須存放于涼爽處。2. 樣品不能及時送檢時可用充足的干冰保存過夜。肌肉樣品冷凍與保存1. 樣品經(jīng)異戊烷予冷器處理冷凍在-160液氮中，也可使用丙酮和干冰的混合液冷凍，肌肉冷凍后最好密封貯存在-70，防止酶活性和水分丟失，肌肉樣品在液氮或-70冰箱中可長期保存。2. 經(jīng)上面方法處理的標(biāo)本肌肉纖維形態(tài)好，光鏡檢查時可獲得大多數(shù)診斷信息。3. 為了避免人為現(xiàn)象，送檢樣品冷凍處理時應(yīng)該迅速電鏡樣品固定1. 部分樣品固定于4%戊二醛，固定的肌肉組織多用塑料包埋劑包埋。2. 電鏡分析可以很清楚顯現(xiàn)肌膜毛細(xì)血管。石蠟包埋材料1. 石蠟包埋的材料有利于炎癥和炎細(xì)胞形態(tài)觀察，但是石蠟切片肌纖維的形態(tài)較差。2. 福爾馬林固定、石蠟包埋切片無法進(jìn)行對于某些組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色，因此為了滿足診斷需要，多數(shù)肌肉活檢樣品需要立即進(jìn)行冷凍保存或新鮮標(biāo)本送檢。3. 需要石蠟包埋切片的標(biāo)本應(yīng)用福爾馬林固定。病理實驗室肌肉活檢樣品常規(guī)處理方法骨骼肌活檢，應(yīng)盡量避免出現(xiàn)人為現(xiàn)象。根據(jù)檢查的目的進(jìn)行必要的處理。標(biāo)本處理原則上要滿足組織化學(xué)、電鏡和生物化學(xué)檢查的要求。例如，線粒體異常需要另外保留分離線粒體的樣品。如果需要做去皮纖維（skinned fiber或破膜纖維）檢查，需要將標(biāo)本保存在緩沖液中。組織化學(xué)檢查活檢的肌肉標(biāo)本要用生理鹽水浸濕的紗布包裹，放入玻璃瓶內(nèi)，紗布應(yīng)該稍微擠干些，避免水分過多，水分過多容易肌肉膨脹。樣品直接暴露在空氣中很容易干燥。干燥的樣品肯定會出現(xiàn)人為現(xiàn)象，影響制片和診斷。操作過程中盡量避免產(chǎn)生人為現(xiàn)象。一般活檢的肌肉組織（直徑5mm，長度1cm左右），固定于軟木塞上。軟木塞可選用小瓶塞（直徑11.5cm）將肌肉組織豎立在軟木塞上，用托辣甘樹膠（黃蓍樹膠）直立固定肌肉，切片時使呈橫斷面。注意不要將肌肉完全包埋在黃蓍樹膠中。肌肉組織需要驟冷冷凍，不然會產(chǎn)生冰晶。肌肉組織的細(xì)胞比較大，特別容易產(chǎn)生冰晶。含有冰晶的肌肉組織染色后細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)大小不等的空泡。為了快速冷凍，一般使用液氮（-160），丙酮、干冰混合液（-90）。如果將組織直接放入液氮內(nèi)組織周圍產(chǎn)生大量的汽化液泡，產(chǎn)生熱隔斷效應(yīng)，會延遲冷凍速度。所以現(xiàn)在的方法是先將產(chǎn)生氣泡較少的異戊烷冷卻于液氮中，再將組織放在充分冷卻的異戊烷中進(jìn)行凍結(jié)。100ml燒杯在頸部系上牽繩，往燒杯中加6070ml異戊烷，將燒杯輕輕放入液氮中。為了使異戊烷冷卻均勻，用攪拌棒或鑷子不斷攪拌異戊烷，開始時液氮因激烈汽化而冒出白煙，而后逐漸減少。異戊烷充分冷卻后，在燒杯中產(chǎn)生白色結(jié)晶。用大鑷子夾住軟木塞，迅速置入異戊烷中，迅速左右輕柔地晃動。托辣甘樹膠粘附固定肌肉目的就是在充分冷卻的異戊烷中輕柔細(xì)微地晃動。如果將組織靜置在異戊烷中，組織周圍異戊烷的溫度升高，包裹在組織周圍，不能迅速徹底凍結(jié)，組織容易形成冰晶，組織輕微晃動冷凍液充分流動，使組織迅速凍結(jié)，很難形成冰晶。在異戊烷中冷凍20-30秒鐘。移入放有干冰的箱中，放置1小時，使組織周圍的異戊烷揮發(fā)干凈。放入能密封的塑料袋或玻璃瓶中避免組織干燥，置-70冰箱中保存。-70以下密封保存最少可保存1年，不會影響組織化學(xué)檢查結(jié)果。我們觀察保存10年以上的標(biāo)本，染色后的效果和新鮮組織沒有明顯差別。恒溫冷凍切片冷凍切片機(jī)內(nèi)部的溫度-25-20為宜。低于-25時，肌肉過硬，容易出現(xiàn)橫皺，高于-20時含脂肪、結(jié)締組織的肌肉伸展不良。容易出現(xiàn)皺褶現(xiàn)象。最好在載玻片粘貼23行連續(xù)切片的組織。冰凍切片室溫保存23天進(jìn)行任何染色都不會使活性降低，但室溫保存5天以上，ATPase染色或Phosphoryase(磷酸化酶)染色效果較差。另外，改良Gomori染色法最好在切片當(dāng)天進(jìn)行。肌肉組織活檢冷凍步驟用品1. 液氮2. 異戊烷Isopentane (2 methyl butane)3. 長把手鑷子4. 兩個金屬容器5. 手套6. 一次性軟木塞安全與防護(hù)注意：異戊烷非常易燃，不要讓該材料到達(dá)室溫，放入液氮時使用防護(hù)眼鏡。試劑配制7%托辣甘樹膠（Gum Tragacanth）托辣甘樹膠7g蒸餾水100ml麝香草酚5粒托辣甘樹膠加入蒸餾水中溶解，再加入5粒麝香草酚，室溫攪拌。注：托辣甘樹膠非常難溶解，溶液可放在室溫間斷攪拌。配制后4保存，保質(zhì)期6個月。(口香糖的主要成分為托辣甘樹膠，口香糖用開水或溫水浸泡5min，然后再用蒸餾水幾次，用清洗后的口香糖代替托辣甘樹膠使用，用于粘附固定組織效果并不受影響?？谙闾堑氖褂梅椒▋H本人試用，主要顧慮是否會影響PAS染色，口香糖的使用需要更多的實踐檢驗)。肌肉冷凍步驟1 放適當(dāng)量的托辣甘樹膠于軟木塞上，將病人姓名和病理編號寫到軟木塞或貯存肌肉樣品的容器上。2 將肌肉組織放在托辣甘樹膠中（肌肉組織需要暴露1/3或1/2托辣甘樹膠之上，不要完全埋到托辣甘樹膠中）。肌肉埋入的方向垂直，肌絲橫斷面向上（切片為橫斷面）。3 準(zhǔn)備一個100ml小燒杯裝入6070ml異戊烷，用規(guī)格為700mm的濾紙包住小燒杯的口，再用橡皮筋扎住小燒杯周邊的濾紙小心放入液氮中，不要將異戊烷浸到液氮中，讓異戊烷降到-140，異戊烷下面凍成固體上面呈液態(tài)時即可開始冷凍。4 用長鑷子夾住軟木塞將準(zhǔn)備好的肌肉組織朝下浸到異戊烷中迅速冷凍，并在異戊烷中輕輕地晃動10秒左右，加快冷凍速度，避免形成冰晶。5 用鑷子夾住軟木塞不動維持20秒鐘，（較小于0.3cm的組織5秒鐘）冷凍過程中不要將肌肉組織離開異戊烷，直到組織冷凍完成。6 小心將冷凍的組織包埋塊拿出來，迅速放入預(yù)冷的容器中密封貯存或及時做冰凍切片。或在-70以下無限期保存。7 冷凍后的異戊烷回收到原容器中，蓋緊瓶蓋，4冰箱儲存，冷凍肌肉組織的異戊烷可以反復(fù)使用，并不影響冷凍效果。異戊烷易揮發(fā)，易燃，使用是應(yīng)注意。冰凍切片操作步驟1. 防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆或柔軟的紙張清除殘余組織碎片。必要時每切完一張切片后就用紙擦一次。因為切片時組織很容易附貼在防卷板和切片刀之間，如果有殘余的包埋劑粘附切片刀或放卷板上，切片容易出現(xiàn)皺折，或組織片斷裂，很難獲得完整的切片。2. 如果幾個病例同時做冰凍切片，應(yīng)將組織分別放于不同的支承器上，放到冷凍臺上冷凍，然后跟據(jù)不同病例的編號，按順序進(jìn)行切片，并在切片上標(biāo)記該組織的編號。防止張冠李戴。良好的工作習(xí)慣，周到的工作計劃，能夠有效提高工作效率，使工作忙而不亂。3. 切片時發(fā)現(xiàn)組織冷凍過度，可將冰凍包埋的組織塊連同支承器取出來，在室溫停留片刻，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，還可以把冷凍溫度點(diǎn)稍微升高一點(diǎn)。來緩解冷凍過度的程度，讓組織盡快達(dá)到合適的切片溫度。4. 用于附貼冰凍切片的載玻片，室溫下應(yīng)用，不必放入冷藏或冷凍。因為附貼切片時，室溫下的載玻片與冷凍箱中的切片有一定的溫差，當(dāng)溫度較高的載玻片與溫度較低切片接觸時，冰凍切片很容易貼到載玻片上。而冷藏或冷凍過的載玻片就不容易貼牢，需要提高溫度才能貼牢。切片附貼時容易產(chǎn)生氣泡。5. 肌肉活檢Gomori三色和改良還原型輔酶四唑藍(lán)還原酶染色法組織切片不需要固定。其余染色方法根據(jù)所這證實的組織成分選用最佳固定液固定。肌肉活檢樣品的染色方法改良還原型輔酶I四唑藍(lán)還原酶（NADH-TR）氧化酶組織化學(xué)染色法固定：不需要固定切片：冰凍切片10um試劑配制：染色液還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）-Sigma N8129 8mg 硝基四唑氮藍(lán)(Nitro blue tetraolium-Sigma N6876)10mg0.2mol Tris HCl緩沖液pH7.410ml二甲亞砜（DMSO）0.51ml以上試劑臨用前新鮮配制，配制方法將NNADH，NBT，Tris-Hcl混合后加入DMSO然后用玻璃棒攪拌23分鐘，過濾后使用。根據(jù)上面配方我們在應(yīng)用時進(jìn)行了一點(diǎn)變通下面是我們采用的配制方法：A液還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）-Sigma N8129 8mg 0.2mol Tris HCl緩沖液pH7.4 5ml還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）溶解于Tris HCl緩沖液中。B液硝基四唑氮藍(lán)(Nitro blue tetraolium-Sigma N6876)10mg0.2mol Tris HCl緩沖液pH7.4 5ml硝基四唑氮藍(lán)(Nitro blue tetraolium)溶解于Tris HCl緩沖液中。C液二甲亞砜（DMSO）10ulA液和B液分別分裝到EP管中，每管50ul，-20儲存。臨用時室溫解凍， A液50ul和B液50ul混合再加入C液10ul。可以染12張肌肉組織冰凍切片。長期（6個月）-20儲存染色不會產(chǎn)生任何影響。這種變通可以免去每次染色前稱量繁瑣過程。染色步驟1. 冰凍切片放入濕盒中滴加染色液置37恒溫箱1020mins。2. 流水沖洗1min。3. 蒸餾水洗3次。4. 甘油-明膠封片。結(jié)果：基質(zhì)網(wǎng)和線粒體呈紫藍(lán)色，型肌纖維比型肌纖維顏色黑些，血管壁同時也被染色。GOMORI 三色法染色步驟原理Gomoris一步三色法是原生質(zhì)染料（鉻變素2R）與結(jié)締纖維（固綠FCF）在鎢酸液中加入了冰醋酸一種聯(lián)合染色樣品要求迅速冷凍人橫紋?。ɡ们懊嫣岬降漠愇焱槔鋬龇ǎ┓椒ü潭?不需要，使用速凍的組織技術(shù)方法 速凍的組織經(jīng)恒溫冷凍切片機(jī)上切1016微米，附貼于蓋玻片或載玻片上，按需要決定切片數(shù)量。設(shè)備品 染色架 染色碟 染色缸 鑷子 乳膠手套試劑1. 冰醋酸（Glacial Acetic Acid -Fisher A507-500, CORROSIVE store at room emperature）。2. 鉻變素2R（Chromotrope 2R - Sigma C3143, IRRITANT, store at room temperature）。3. 去離子水。4. 固綠FCF（Fast Green FCF - certified, Sigma F7258,GLOVES AND MASK REQUIRED, store at room temperature）5. Harris蘇木精染液6. Permount - Fisher SP15-100, FLAMMABLE HEALTH HAZARD7. 磷鎢酸 游離酸- Sigma P4006, CORROSIVE, store at room temperature8. 乙醇9. 二甲苯溶液1. Gomoris trichrome stain鉻變素2R 0.6g固綠FCF 0.3g磷鎢酸 0.6g去離子水 100ml冰醋酸 1.0ml使用1N氫氧化鈉調(diào)pH至3.4，室溫保存，液體1周內(nèi)有效。2. 0.2%冰醋酸去離子水 100ml冰醋酸 0.2ml3. 50%乙醇乙醇50 ml蒸餾水 50 ml4. 70%乙醇乙醇 70 ml蒸餾水 30 ml5. 80%乙醇乙醇 80 ml蒸餾水 20 ml6. 950%乙醇乙醇 95 ml蒸餾水 5 ml染色步驟（Staining Procedure）1 將切片插入染色架上2 Harris蘇木精染5min3 自來水沖洗min4 Gomri 三色液染色10min5 0.2%醋酸浸幾次要充分分化6 直接用95%乙醇洗7 繼續(xù)用上行乙醇液（95%2,100%2）脫水8 二甲苯透明（34）9 中性樹膠封固，并標(biāo)記切片結(jié)果細(xì)胞核紅色-紫紅正常肌肉肌原纖維具有不同的綠色A和I折射帶Itermyofibrillar muscle membranes: Red間質(zhì)膠原 綠色改良Gormori三色染色法此染色法對線粒體肌病和先天性肌病的診斷非常有價值。Gormoris液A液變色酸2R0.6g固綠FCF0.3g磷鎢酸0.6g冰醋酸1ml蒸餾水99ml用1M氫氧化鈉調(diào)pH3.4B液冰醋酸0.2ml蒸餾水100ml組織樣品肌肉組織經(jīng)防冰晶處理后，冰凍切片不固定，切片5-10微米，肌纖維橫切。染色步驟1. 冰凍切片，室溫下晾干切片。2. 用Harris蘇木精染5mins。3. 蒸餾水洗。4. 切片放入A液中染10mins。5. 用B液沖洗切片幾秒鐘。6. 乙醇脫水。7. 二甲苯透明，樹膠封固。結(jié)果：核藍(lán)色型肌纖維綠色帶有紅色型肌纖維綠色說明：1. 兩型肌纖維都是綠色，但型肌纖維含有更多紅染色顆粒物質(zhì)而帶有紅顏色。2. 此方法是一種改良Gormori三色染色法。PAS（Periodic Acid Schiff）染色方法簡述：該方法用于福爾馬林固定石蠟包埋切片的肝、心臟和骨骼肌組織中的糖原檢測，還可以用于冰凍切片，糖原，粘液和真菌被染成紫色細(xì)胞核被染成藍(lán)色。固定：10%福爾馬林。切片：石蠟5微米試劑配制：1. 0.5%過碘酸水溶液過碘酸0.5g蒸餾水100ml2. Schiff 試劑堿性復(fù)紅（CI42500）6g蒸餾水1200mlN 鹽酸60ml偏重亞硫酸氫鈉12g用600ml蒸餾水溶解6g堿性復(fù)紅，煮沸幾分鐘，冷卻到50加入60ml N鹽酸，冷卻到25加入12g偏重亞硫酸氫鈉（高純度化學(xué)試劑）。液體放于暗處24小時。24小時后加56g活性炭，搖動大約1分鐘。通過粗過濾紙過濾，液體應(yīng)該清亮，如果液體有顏色重復(fù)加入活性炭。最后補(bǔ)充蒸餾水至液體到總量600ml，放入棕色瓶中冰箱內(nèi)保存。Schiffs 試劑質(zhì)量測試：量10毫升37%甲醛倒入透明小玻璃瓶中，加幾滴Schiff 試劑測試，質(zhì)量好的Schiff 試劑會立刻變成紫紅色。質(zhì)量不好的Schiff 試劑會延長反應(yīng)，而且顏色畸形伸長會變深呈藍(lán)-紫色。另外，用水測試，把Schiff 試劑直接滴入水中，立即出現(xiàn)洋紅色說明試劑質(zhì)量很好，出現(xiàn)粉紅色或無色，說明質(zhì)量不合格或過期，應(yīng)該從新配制。Schiff 試劑保存：常規(guī)棕色瓶內(nèi)貯存，冰箱內(nèi)4保存。這種條件下保存的Schiff 試劑最長有效時間不超過1年。有些有效期更短，3個月，甚至12個月。具有關(guān)資料介紹Schiff 試劑配制后進(jìn)行分裝冷凍保存可以延長試劑的有效時間。融化后使用，染色效果和新配制的Schiff 試劑比較沒有區(qū)別?？梢员４鏀?shù)年，本人使用過冷凍貯存4年以上的Schiffs試劑，并不影響染色結(jié)果。3. Mayers蘇木精液PAS染色步驟1. 切片脫蠟至水。2. 0.5%過碘酸氧化5分鐘。3. 蒸餾水沖洗。4. Schiffs 試劑染15分鐘（切片變?yōu)榉奂t色）。5. 自來水沖洗5分鐘。（切片變成深紅色）。6. Mayers蘇木精染1分鐘。7. 自來水沖洗5分鐘。8. 95%乙醇，100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：糖原，粘液和基底膜-紅色/粉紅色.,背景-藍(lán)色。PAS/D-糖原淀粉酶消化染色法簡述：-淀粉酶是一種消化酶，唾液中含有淀粉酶。對照：相同的組織塊上切兩張切片。一張消化另一張不消化。然后兩張切片都用PAS染色。肝臟是最好的對照組織。試劑配制：1. 消化液淀粉酶（用-淀粉酶）0.05g蒸餾水50ml首先Sigma產(chǎn)品-淀粉酶 VI-B 產(chǎn)品號A3176。用蒸餾水慢慢溶解酶。新鮮配制，15分鐘內(nèi)使用，用后丟棄。2. 0.5%過碘酸過碘酸2.5g蒸餾水500ml3. Schiffs試劑堿性復(fù)紅（CI42500）6g蒸餾水1200mlN 鹽酸60ml偏重亞硫酸氫鈉12g用600ml蒸餾水溶解6g堿性復(fù)紅，煮沸幾分鐘，冷卻到50加入60ml N鹽酸，冷卻到25加入12g偏重亞硫酸氫鈉（高純度化學(xué)試劑）。液體放于暗處24小時。24小時后加56g活性炭，搖動大約1分鐘。通過粗過濾紙過濾，液體應(yīng)該清亮，如果液體有顏色重復(fù)加入活性炭。最后補(bǔ)充蒸餾水至液體到總量600ml，放入棕色瓶中冰箱內(nèi)保存。染色步驟1. 石蠟切片脫蠟至蒸餾水。2. 用微波爐加熱淀粉酶液20秒。3. 放標(biāo)記消化切片用加熱的淀粉酶液消化15分鐘，不要過度化消。4. 自來水沖洗，蒸餾水洗。5. 兩種切片同時按PAS步驟染色。結(jié)果：未經(jīng)淀粉酶消化的切片糖原被PAS染成洋紅色，經(jīng)淀粉酶消化的切片消失。說明：如果切片消化過度，組織需要重切。消化過度有花邊現(xiàn)象，甚至沒有組織留下。Highmans剛果紅染色法（Highman 1946）這是一種簡便、廣泛被應(yīng)用的染色方法。染液的穩(wěn)定性相當(dāng)好。該方法經(jīng)有經(jīng)驗的老手選擇提供。資料來源組織學(xué)技術(shù)Theory and Practice of Histological Techniques (第六版)。固定：不關(guān)鍵；福爾馬林鹽能獲得滿意的結(jié)果。試劑配制：1. 0.5%剛果紅溶液（0.5g剛果紅溶解于50%乙醇100ml）。2. 0.2%氫氧化鉀液（0.2g氫氧化鉀溶解于80%乙醇100ml）。染色步驟1. 切片脫蠟至水，必要時祛除色素。2. 剛果紅液染5分鐘。3. 0.2%氫氧化鉀液分化310秒。4. 水洗，明礬蘇木精染核，分化，返藍(lán)。5. 脫水，透明，封固。結(jié)果：淀粉，彈力纖維，噬伊紅顆粒-紅色。 核-藍(lán)色。說明：第3步分化，可以用水終止，分化過度可能會發(fā)生，如果必要可以重復(fù)。PTAH染色法（Shum&Hon 1969）A液蘇木精0.8g蒸餾水1ml 0.8g蘇木精加1ml蒸餾水研磨成糊狀，（糊狀液體應(yīng)該呈巧克力顏色，顏色淡的通常是指示劑不適合此方法染色，應(yīng)該丟棄）。B液磷鎢酸0.9g蒸餾水9mlA液和B液混合，煮沸，冷卻后過濾。染色步驟1. 切片脫蠟至水。2. 酸性高錳酸鉀處理5分鐘。3. 自來水沖洗。4. 5%草酸水溶液漂白。5. 充分自來水洗。6. 染PTAH液1224小時，室溫。PTAH液56染幾個小時，結(jié)果更確切完全可以代替室溫下染色。7. 蒸餾水洗。8. 迅速脫水，透明，封固。PTAH液自然氧化方法油紅O脂質(zhì)和脂肪染色用途：顯示脂質(zhì)和脂肪。固定：10%幅爾馬林。冰凍切片：48微米。染色液配制10.5%油紅O溶液油紅O 0.5g100%異丙醇100ml加入少量的異丙醇溶解油紅O并攪拌，逐漸加入剩余的異丙醇，加熱溶液到95左右，不超過100，冷卻到室溫用濾紙過濾?；蚴覝剡^夜，用特殊玻璃裝置真空抽吸，配制的溶液在室溫中可保存數(shù)年。如果液體表面有膜形成可以用一張薄紙片除去。285%異丙醇溶液異丙醇（100%）85ml蒸餾水15ml3Gills蘇木精染色步驟1 空氣中干燥切片30min，用10%福爾馬林固定5min。2 蒸餾水洗3次。3 100%異丙醇5min，防止切片上的水帶入油紅O染液中）4 油紅O液60染色8分鐘。5 85%異丙醇溶液洗5分鐘。6 蒸餾水洗3min。7 Gills蘇木精染色30秒。8 流水沖洗3min。9 蒸餾水洗2次。10 甘油明膠封片。結(jié)果：脂肪紅色，細(xì)胞核淡藍(lán)色。改良油紅O-糊精染脂肪色法（Churukian 2000）固定：新鮮冰凍組織中性緩沖福爾馬林。切片：冰凍切片5微米，SuperFrost 載玻片貼片，空氣中晾干切片。試劑配制：油紅O液油紅O0.5g純異丙醇100ml混合后過夜糊精水溶液糊精1g蒸餾水100ml工作液儲備液油紅O液60ml糊精水溶液40ml或油紅O液油紅O0.9g純異丙醇180ml攪拌過夜糊精水溶液糊精 1.2g蒸餾水 120ml工作液油紅O液180ml糊精水溶液120ml放置1天或更長時間，液體可穩(wěn)定數(shù)月。使用前過濾。染色步驟1. 切片直接放入過濾的油紅O-糊精液中染色20分鐘。2. 流水稍沖洗。3. 對比染色用Gill 蘇木精染20-30分鐘。4. 流水沖洗返藍(lán)。5. 水溶性封固劑封固。結(jié)果：脂肪燦爛紅色核藍(lán)色。* Dextrin, bacteriological grade or Type Sigma, from com. Dextrin is hydrolyzed com starch. VWR(VWR Scientific) also has small quantities; must be most soluble form of dextrit勞克監(jiān)牢藍(lán)法勞克監(jiān)牢藍(lán)屬于銅-鈦菁染料（copper-phthalocyanine dye），在酒精溶液中具有與髓鞘磷脂結(jié)合的染色特性，再經(jīng)過中性紅或焦油紫復(fù)染還能染出神經(jīng)元的胞核及尼氏小體，而且對髓鞘著色反應(yīng)具有強(qiáng)化作用。固定：10%福爾馬林生理鹽水或福爾馬林-鈣液。切片：石蠟切片15-20微米，火棉膠或冰凍切片均可。試劑配制：1. 勞克監(jiān)牢藍(lán)液勞克監(jiān)牢藍(lán)MBS 0.1g10%醋酸液0.5ml95%酒精100ml染液配制后過濾使用，可以長期保存。2. 0.5%中性紅水溶液染色步驟1 切片脫蠟入無水酒精。冰凍切片直接入無水酒精。2 放入染液中染色816小時，60，染色缸需要密封。3 經(jīng)70%酒精，然后蒸餾水洗。4 0.05%碳酸鋰水溶液分色，石蠟切片1030秒，厚冰凍切片10分鐘。5 再經(jīng)70%酒精繼續(xù)分色兩次，每次3060秒。至灰、白質(zhì)區(qū)分清晰。如果還不清晰可繼續(xù)分色。6 蒸餾水洗。7 0.5%中性紅水溶液加數(shù)滴冰醋酸復(fù)染10min（1030min，視鏡檢、分色而定）。8 70%酒精進(jìn)行復(fù)染分色，至細(xì)胞核及尼氏小體呈紅色。9 正丁醇脫水兩次，35min/次，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：髓鞘藍(lán)色，細(xì)胞核及尼氏小體紅色。注：復(fù)染還可應(yīng)用PAS，Mallory磷鎢酸-蘇木精法顯示神經(jīng)膠質(zhì)，Holmes度銀顯示軸索，油紅O顯示潰變退化的髓鞘。改良Glees和Marsland染色法試劑：1 20%硝酸銀水溶液：2 Glees溶液：20%硝酸銀30ml，無水酒精20ml，氨水。將酒精加入硝酸銀液中，立即出現(xiàn)乳白色沉淀再逐滴加入氨水直到沉淀溶解為止。最后再滴加4滴氨水，過濾后使用。3 5%硫代硫酸鈉水溶液：硫代硫酸鈉5g，加蒸餾水至100ml。染色步驟1 石蠟切片脫蠟至蒸餾水。2 預(yù)熱3720%硝酸銀水溶液浸染30mins（切片為淡黃色）。3 不洗，直接入10%福爾馬林液直到液體變清為止。4 快速過Glees溶液后，再放入Glees溶液30秒1 min。5 取出切片，用濾紙吸干組織周圍多余Glees溶液。6 不洗，直接放入10%福爾馬林液還原23mins，更換23次10%福爾馬林液。7 自來水洗，然后換蒸餾水洗。8 5%硫代硫酸鈉水溶液固定切片5mins。9 充分自來水洗。10 95%酒精，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：神經(jīng)元軸突及神經(jīng)纖維-黑色，背景-黃色。第5步應(yīng)鏡下控制，如浸度不夠深可再重復(fù)第4步一次。所用玻璃器皿，玻片應(yīng)化學(xué)純凈，這樣可減少非特異性著色及氨銀夜污染。堿性磷酸酶染色法Gomori鈣法（Gomori 1951，改良）固定：福爾馬林鈣4。切片：冰凍切片，后固定。試劑配制：孵育媒介液配制2%甘油磷酸鈉2.5ml2%巴比妥鈉2.5ml2%硝酸鈣5ml1%氯化鎂0.25ml蒸餾水1.25ml孵育媒染液的最終pH 9.09.4。巴比妥鈉起著媒介緩沖作用而鎂離子作為酶的激活劑。染色步驟1. 適當(dāng)固定后切片至水。切片放入孵育媒介液37孵育25分鐘到6小時。2. 充分蒸餾水洗。3. 重復(fù)洗。4. 切片用2%硝酸鈷處理3分鐘。5. 充分蒸餾水洗。6. 重復(fù)洗。7. 切片浸入1%硫化銨2分鐘。8. 充分蒸餾水洗。9. 甲基綠（氯仿提?。Ρ热旧?0. 充分自來水洗。11. 甘油-明膠封固。結(jié)果：活躍的堿性磷酸酶棕黑色核綠色說明：a. 為了方便保存貯存液 按20ml批次配制。b. 孵育時間各異根據(jù)制備的類型，冰凍切片需要的時間最短。琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase,SDH）染色1. 在下面液體內(nèi)37孵化30min。1）0.2mo/L琥珀酸鈉15ml2）0.2mo/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）15mlNBT 30mg調(diào)整pH至7.2-7.62. 依次入30%60%90%6030%丙酮（時間延長會褪色，操作要迅速。30%可省略）3. 水洗4. 甘油明膠封片作為氧化酶的SDH與NADH-TR同樣存在著局限性。NBT被還原后產(chǎn)生甲臘（formazan）顆粒沉淀。染色結(jié)果也接近于NADH-TR，但顏色較淡，肌纖維類型也較難分別。但與NADH-TR相比，線粒體特異性較強(qiáng)，對線粒體腦肌病的診斷很有幫助。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）染色1. 下面液體內(nèi)37孵化30min。乳酸鈉 1.5mlNBT30mgNAD12mg0.2 mol/LTris鹽酸緩沖液（pH7.4）30ml調(diào)整pH至7.02. 依次入30%60%90%6030%丙酮，時間要短。3. 水洗4. 甘油明膠封片與NADH-TR和SDH相比，LDH染色性最差，肌纖維類型的區(qū)分也很困難。除特殊情況外，觀察氧化酶反應(yīng)NADH-TR以很充分，不影響疾病的診斷。ATP酶染色方法一試劑使用如下：1. 甘氨酸緩沖液甘氨酸7.5g 氯化鈉5.8g蒸餾水1000ml2. 氯化鈣緩沖液甘氨酸緩沖液500ml1 M氯化鈣 100ml0.1 M NaOH350ml（大約）用1 M NaOH調(diào)普pH 9.5 3. 醋酸緩沖液 pH 4.30.2 M 醋酸36.8ml0.2 M 醋酸鈉13.2ml蒸餾水100ml4. ATP ( Disodium salt,Sigma chemicals Ltd ) 用于工作液 ATP5mg蒸餾水?dāng)?shù)滴用數(shù)滴蒸餾水溶解ATP5. 二硫蘇糖醇 1 mM ( 每月更換新液)6. 2% 氯化鈷液7. 1% 硫化銨液（ 新鮮配制 ）8. 1% 氯化鈣液9. 反應(yīng)混合液 1滴二硫蘇糖醇( DTT 1 mM )和 ATP工作液加到10ml氯化鈣緩沖液中常規(guī)ATP酶法（pH 9.4）按下列步驟執(zhí)行1. 冰凍切片8微米貼到蓋玻片上2. 反應(yīng)混合液 1滴二硫蘇糖醇( DTT 1 mM )和 ATP工作液加到10ml氯化鈣緩沖液中立式染色缸中 37 30分鐘3. 1% 氯化鈣液充分洗23分鐘4. 2% 氯化鈷液 2次 每次1分鐘5. 蒸餾水徹底沖洗4次6. 1% 硫化銨液（ 新鮮配制 ）30秒（ 此步驟在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行 ）7. 顏色顯影后用蒸餾水沖洗，甘油明膠封固ATP轉(zhuǎn)換酶染色法如下1. 切片放入pH 4.3或pH 4.6醋酸緩沖液37 10分鐘2. 迅速用1:4V/V稀釋氯化鈣緩沖液洗3. 常規(guī)ATP酶反應(yīng)液處理，但用1:4V/V蒸餾水稀釋氯化鈣緩沖液洗之前另外加ATP和二硫蘇糖醇( DTT 1 mM )我們發(fā)現(xiàn)新鮮冰凍切片染色結(jié)果好，冷凍后放置幾天的冰凍切片也能成功的染出結(jié)果。ATPase染色方法二本方法是區(qū)別肌纖維類型最好的染色方法，要穩(wěn)定染色方法需要下一番功夫。區(qū)別和型肌肉纖維比較難的原因在于前處理液的pH值準(zhǔn)確性問題。技術(shù)書明確給的前處理液的pH值9.4，但肌病下的pH值10.0.雖然能夠區(qū)別肌纖維類型，但有時候顏色較淡，或者有斑點(diǎn)，原因多半是硫化氨質(zhì)量問題造成的結(jié)果。注意選用高質(zhì)量的化學(xué)試劑，開封后按說明妥善保存。染好的切片放一段時間發(fā)現(xiàn)切片組織上的染色褪色，放置幾個月后染色甚至?xí)В@種現(xiàn)象多半是組織脫水不凈或水溶性封片劑質(zhì)量不好造成的原因。對于ATPase染色的保存?zhèn)鹘y(tǒng)的封片劑加拿大樹膠最好。ResultsPRE-INC pH TYPE 1 TYPE 2A TYPE 2B TYPE 2C9.4 light (0 +1) dark ( +3) dark (+3) dark (+3)4.6 dark ( +3) light ( 0 ) intermediate (+1 +2) intermediate (+1 +2)4.3 dark ( +3) light ( 0 ) light ( 0 ) intermediate (+1 +2)酸性磷酸酶（Acid phosphatase）染色1. 在冷卻到4的下述液體中固定10min。巴比妥醋酸鹽緩沖液（pH5.0）12ml丙酮 18ml2. 水洗3. 下述液體中37孵育60min。4%亞硫酸鈉0.6ml副品紅液0.6ml將兩種液體混合，室溫放置一段時間加入19.5ml蒸餾水。Naphtol AS-B 1 phosphate15mgN,N-dimethyl formamide1.5ml每次分別配制這兩種液體，然后混合，臨用時加入巴比妥醋酸鹽緩沖液7.5ml最后pH值調(diào)整為4.75.0（用2N NaOH調(diào)Ph）4. 水洗5. 0.3%甲基綠30秒（對核對比染色）6. 水洗7. 甘油明膠封片副品紅液 2N-HCl 50ml，加入鹽酸副品紅2g，輕微加熱溶解，室溫冷卻，過濾保存。巴比妥醋酸鹽緩沖液（pH5.0）醋酸鹽0.97g巴比妥鈉1.47g蒸餾水140ml0.1N HCl90ml（大約）酸性磷酸酯酶染色在巨噬細(xì)胞（溶酶體內(nèi)大量存在）和包體內(nèi)有自噬反應(yīng)時呈陽性。乙酰膽堿酯酶（ac