【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用-藥學(xué)

題目 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 作者姓名 趙 帥 指導(dǎo)教師 吳 元 明 二級學(xué)院 醫(yī) 學(xué) 院 專 業(yè) 藥 學(xué) 學(xué) 號 9安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 I 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 摘 要 本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 增和測序方法對一個確診的苯丙酮尿癥（ 系的苯丙氨酸羥化酶（ 6基因序列熱點(diǎn)突變位點(diǎn)及分布特征進(jìn)行研究，優(yōu)化了苯丙酮尿 癥致病基因檢測方法。結(jié)果表明：家系中父親和母親是苯丙酮尿癥致病基因 突變攜帶者，兒子同時遺傳了父親和母親的突變基因，導(dǎo)致其患病，是典型的 系，本研究為苯丙酮尿癥患者產(chǎn)前診斷、治療、遺傳咨詢、優(yōu)生優(yōu)育奠定基礎(chǔ)有重要意義。 關(guān)鍵詞 ： 變熱點(diǎn) 西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 of - in of in AH of of at to of an 安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 錄 引 言 . - 1 - 1 實(shí)驗(yàn)材料 . - 3 - 本來源 . - 3 - 要試劑 . - 3 - 要儀器 . - 3 - 2 實(shí)驗(yàn)方法 . - 4 - 取 . - 4 - 增 . - 4 - 應(yīng)體系 . - 4 - 應(yīng)條件 . - 4 - 脂糖凝膠電泳 . - 5 - 脂糖凝膠的制備 . - 5 - 板的制備 . - 5 - 樣 . - 5 - 泳 . - 6 - 察 . - 6 - 序 . - 6 - 計(jì)學(xué)分析 . - 6 - 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 . - 6 - 4 討論 . - 8 - 結(jié) 論 . - 9 - 參考文獻(xiàn) . - 10 - 致 謝 . - 12 - 附 錄 . - 13 - 西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 - 1 - 引 言 苯丙酮尿癥 （ 一種氨基酸代謝異常的遺傳病。因其致病基因在常染色體上，所以發(fā)病幾率和性別無關(guān) 1。根據(jù)發(fā)病機(jī)制不同，學(xué)者把苯丙酮尿癥分為兩個類型，一類是典型 因是苯丙氨酸羥化酶（ 因突變導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶缺乏所致，占 全部疾病的 98% 99% ； 另 一 類 是 四 氫 生 物 喋 呤 缺 乏 癥（ 病因是苯丙氨酸羥化酶的輔酶，四氫生物喋呤（ 乏所致，占 1% 2%。 主要臨床表現(xiàn)為，皮膚色淺、頭發(fā)細(xì)黃、虹膜淡黃色，同時尿有 “發(fā)霉 ”臭味或鼠尿味，智力低下；而且 60%患兒有腦電圖異常和繼發(fā)性癲癇 2，嚴(yán)重者甚至可能導(dǎo)致死亡 3。 苯丙酮尿癥在全世界有廣泛的發(fā)病幾率，但也因地區(qū)及種族有明顯差異，發(fā)病率總體約為 1： 500 1： 100004。有文獻(xiàn)報道，苯丙酮尿癥發(fā)病率白種人大于黑種人和黃色人種。其中 ： 26005、 為 1： 14000、 為 1： 4400、 為 1： 7000、 為 1： 784006。根據(jù)國家新生兒篩查中心（ 供數(shù)據(jù)顯示，我國新生兒苯丙酮尿癥發(fā)病率為 1/11 5727。而陜西省 2004 年 2009 年的新生兒的苯丙酮尿癥發(fā)病率高達(dá) 1/3425。也有文獻(xiàn)報道我國 病存在著北方高于南方，東部地區(qū)低于中部和西部地區(qū)的特點(diǎn) 8。苯丙酮尿癥作為可治療的遺傳代謝性疾病之一，若能達(dá)到早診斷、早治療，就能有效地控制該病的發(fā)生與發(fā)展，最大限度地減少社會和家庭的負(fù) 擔(dān)，為提高我省人口素質(zhì)具有一定意義。 致病基因的發(fā)現(xiàn)可以追溯到 1983 年，苯丙氨酸羥化酶（ 因被成功分離、克隆 9。苯丙氨酸羥化酶（ 因位于常染色體 約由 基組成。 因是割裂基因，編碼區(qū)包含 13 時被 12 分隔。轉(zhuǎn)錄時剪接 成僅包含 1353單鏈，即包含 451 密碼子的可譯框。信使核糖核酸（ 翻譯成含 451 氨基酸的酶單體，單體聚合成有功能的 10,11。截至 ，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn) 564 種突變（ ）。 因的突變大部分位于編碼區(qū)的基因的突變，在苯丙氨酸羥化酶基因中僅僅影響一個或多個氨基酸，其西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 - 2 - 對酶活性的影響強(qiáng)烈依賴于突變的形式和位置，根據(jù)對苯丙氨酸羥化酶酶活性有無影響，突變又可分為致病突變和沉默突變。致病突變大多位于 ，嚴(yán)重影響苯丙氨酸羥化酶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯及蛋白質(zhì)的異常折疊、聚合，以及加速降解，從而影響苯丙氨酸羥化酶的催化活性。沉默突變對苯丙氨酸羥化酶活性無影響。 苯 丙酮尿癥中 5 種重要的酶參與輔酶四氫生物喋呤的合成或代謝循環(huán)，可以說其中任何一種酶基因的缺陷均可導(dǎo)致 乏型 非經(jīng)典型苯酮尿癥 ,也稱惡性苯酮尿癥 )。 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等三種芳香族氨基酸羥化酶作用所必需的輔助因子，而 66合成 關(guān)鍵酶之一，其缺陷是 乏型 最常見病因。盡管經(jīng)典 發(fā)病率低于西方人，但有調(diào)查表明我國漢族人群 乏型 西方人為多 12。 追溯到 1986 年就有通過生化手段進(jìn)行 乏型 產(chǎn)前診斷的報道，但因羊水中的生物蝶呤極不穩(wěn)定 ,學(xué)分析方法較復(fù)雜而使其應(yīng)用受到限制 13 66 成必需的催化酶， 最主要原因。 長約 9 有 6 個 碼 145個氨基酸，已報道的突變主要分布在 5、 6。 苯丙酮尿癥致病基因苯丙氨酸羥化酶 和 6 1）突變位置多變：所有 5 3 均發(fā)現(xiàn)突變 。（ 2）突變類型多樣：有錯義突變（ 、小缺失突變（ 、剪接位點(diǎn)突變（ 、沉默突變（ 7%）、無義突變（ 、小插入（ 1%）、大片段插入罕見（ A，母親的突變位點(diǎn)是 ，兒子分別遺傳了父母的突變基因，為復(fù)合雜合突變類型（見表 3其中 本 次 研 究 新 發(fā) 現(xiàn) （ 圖 3C）， 在 國 際 據(jù) 庫（ ）中尚未報到，提交并已被國際 因突變數(shù)據(jù)庫收錄。另一苯丙酮尿癥致病基因 家系中均未檢測到突變。 表 3苯丙酮尿癥致病基因苯丙氨酸羥化酶基因突變檢測結(jié)果 姓 名 核苷酸改變 蛋白質(zhì)改變 突變位置 突變類型 父 親 - 剪接 母 親 錯義 兒 子 - 剪接 錯義 圖 3變檢測的測序結(jié)果。紅色箭頭所指為 突變位點(diǎn)。 A：父親； B：母親； C: 兒子。 西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 - 8 - 圖 3變檢測的測序結(jié)果。紅色箭頭所指為突變位點(diǎn)。 A：父親； B：母親；C: 兒子。 4 討論 因的突變大部分位于編碼區(qū)的小的遺傳學(xué)變化，在苯丙氨酸羥化酶基因中僅僅影響一個或多個氨基酸，其對酶活性的影響強(qiáng)烈依賴于突變的形式和位置。根據(jù)突變類型對 活性的影響情況，突變可分為致病突變和沉默突變兩種。沉默突變對 活性無影響。致病突變大多位于 重影響 合，以及加速降解，從而影 響 催化活性 19。本研究共發(fā)現(xiàn)了 2 種突變，包括 1 種錯義突變和 1 種剪接位點(diǎn)突變。其中剪接位點(diǎn)突變和由于直接影響了蛋白的轉(zhuǎn)錄或翻譯，通常被認(rèn)為是致病性突變，而錯義突變的致病性質(zhì)是需要經(jīng)過體外表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)分析等進(jìn)一步研究證明 20。 本研究的家系中 因沒有顯示突變，由于 陷所致 病率低，對一個家系而言突變是相對固定的。但是對于 陷癥進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，可以對先證者和父母的突變分析的基礎(chǔ)上，選擇合適的分子生物學(xué)手段，如以 工增加限制酶位點(diǎn)、 列分析和最新發(fā)展的 片等技術(shù)，這樣就可以對絕大多數(shù) 陷癥進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。 本課題對 者 因和 因突變位點(diǎn)的探討，為家系 有效降低 病率，提供可靠科學(xué)依據(jù)，對減少 兒的發(fā)生，提高人口素質(zhì)具有重要意義，同時也為深入開展 基因診斷、產(chǎn)前診斷以及今后的基因治療奠定了基礎(chǔ)。 西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 - 9 - 結(jié) 論 任何疾病的發(fā)生都是遺傳物質(zhì)和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。人類疾病基因和相關(guān)基因的定位、分離和克隆，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶來了空前的機(jī)遇?；蛟\斷是伴隨著遺傳學(xué)和細(xì)胞分子生物學(xué)理論和技 術(shù)迅速發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型診斷技術(shù)。在 病診斷過程當(dāng)中，基因診斷為進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷，疾病篩查奠定基礎(chǔ)，將向著高穩(wěn)定性、高可靠性、高效率以及快速簡便經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展，相信最終將會造福人類。 西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 - 10 - 參考文獻(xiàn) 1 顧學(xué)苑 ,新生兒篩查現(xiàn)狀和展望 J,廣東醫(yī)學(xué) ,21(7):212 顧學(xué)范 ,苯丙酮尿癥的診斷和治療 ,廣東醫(yī)學(xué) ,2000,21(7):5353 M,is in to of J003,17(3):4584 L C, S, D, H,of 983,306:1515 an of 008)316 R, J,Co , a 000,15:997 R , J,003:a 003,21:333 8 羅超權(quán) M1 版 ,河南 :河南醫(yī)科大學(xué)出版社 ,2000:799 ,of in a of 003,33(3):30110 顧學(xué)范 實(shí)用兒科臨床雜志 ,2000,15(5):29711 王慕逖 人民衛(wèi)生出版社 ,1996:14012 J, H, T et by C, , , of 989. 1990,40213 , , , et a of 986, 145:176 14 , et J 1989, 12 :29515 , , , et C, , , of 989. 1990. 40816 R, J,a 安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 - 11 - 003,21:33317 a, b, c, et 009,97:165171. 18 u, et of 998,11: 7619 003,21(4)： 34520 ,a in 003,526(145西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運(yùn)用 - 12 - 致 謝 本研究是在我的導(dǎo)師吳元明副教授的悉心指導(dǎo)下完成的。他淵博的專業(yè)知識，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無華、平易近人的人格魅力對我影響深遠(yuǎn)。不僅使我樹立了遠(yuǎn)大的學(xué)術(shù)目標(biāo)、掌握了基本的研究方法，還使 我明白了許多待人接物與為人處世的道理。在此，謹(jǐn)向吳老師表示崇高的敬意和衷心的感謝！ 感謝第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供了良好的環(huán)境，保障論文順利完成，感謝實(shí)驗(yàn)室各位老師給我的幫助