轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用.doc

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)見下表：轉(zhuǎn)染方法原理應(yīng)用特點(diǎn)磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染不適用于原代細(xì)胞操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差有些細(xì)胞不適用DEAE-右旋糖苷法帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù)但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件病毒介導(dǎo)法通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等逆轉(zhuǎn)錄病毒特定宿主細(xì)胞但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期需考慮安全因素腺病毒通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需考慮安全因素陽(yáng)離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá)瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞（各種轉(zhuǎn)染方法的比較）除上述傳統(tǒng)方法外，近年來(lái)國(guó)際上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其適用宿主范圍廣，操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個(gè)碳個(gè)原子，即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體。這種聚陽(yáng)離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實(shí)驗(yàn)證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí)，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過(guò)去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無(wú)細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的因素 轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，細(xì)胞株本身的特性和活性，細(xì)胞培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白， - 半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響，主要因素有下面幾個(gè)：1轉(zhuǎn)染試劑不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過(guò)這些資料可選擇最適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然，最適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。2細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（50）能確?；蛐筒蛔?。最適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。也就是說(shuō)同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。3轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法，但大多大同小異。轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來(lái)確定最佳轉(zhuǎn)染條件。（1）細(xì)胞培養(yǎng)物健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說(shuō)明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。（2）細(xì)胞密度細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間，總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長(zhǎng)的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度為50%-90%，但這個(gè)需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書。（3）血清血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。不過(guò)轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō)，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，如陽(yáng)離子聚合物等，血清的存在會(huì)影響DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS來(lái)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的。不過(guò)要特別注意：對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。通常的，血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)，因此也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。（4）抗生素細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)添加抗生素來(lái)防止污染，但是這些添加劑可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但有些轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。目前轉(zhuǎn)染試劑因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來(lái)操作，非常方便，省去了污染等麻煩。（5）氮磷（N/P）比N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵（為了換算方便，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示），在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高，之后達(dá)到平值，但毒性也隨之而增加，因此在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)根據(jù)推薦比例，確定本實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)染比例。（6）DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行，但對(duì)GenEscort系列轉(zhuǎn)染試劑影響不大。核酸純化世界第一品牌德國(guó)QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。此外，對(duì)一些內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞（如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過(guò)程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。但如果使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑，一般不需要這么高的DNA質(zhì)量要求。當(dāng)使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，即使采用傳統(tǒng)的酚氯仿沉淀方法純化質(zhì)粒，仍然可達(dá)到非常好的轉(zhuǎn)染效果，但所用的質(zhì)粒量比試劑盒純化方法的DNA用量大一些。4載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞，此外還需考慮一些安全問(wèn)題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行，因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要，同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。轉(zhuǎn)染技術(shù)的要點(diǎn)及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)的要點(diǎn)及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)，它是研究基因表達(dá)調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具。隨著功能研究的興起，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。以下就向大家介紹一些轉(zhuǎn)染的技術(shù)要點(diǎn)及市面上主要的轉(zhuǎn)染試劑類型的選擇。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染效率收多種因素影響，主要因素有下面幾個(gè)：1. 細(xì)胞培養(yǎng)物健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。低的細(xì)胞代數(shù)（50）能確保基因型不變。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說(shuō)明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。2. 血清大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。通常的，血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先測(cè)(轉(zhuǎn)右)試出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好的血清批號(hào)，轉(zhuǎn)染時(shí)用同一批號(hào)的血清，并同時(shí)做負(fù)對(duì)照（不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA）以測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。3. 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞，此外還需考慮一些安全問(wèn)題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行，因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要，同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。4. DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。核酸純化世界第一品牌德國(guó)QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2x CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。此外，對(duì)一些內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞（如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過(guò)程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。5.轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)