快速檢測H5亞型鴨流感病毒

序號： 編碼： 第十屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽作品申報(bào)書作品名稱：用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）新技術(shù) 快速檢測H5亞型鴨流感病毒 學(xué)校全稱： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 申報(bào)者姓名 （集體名稱）： 謝義涵 吳永鋒 周穗婷 甘燕貞 李寶紅 冀君 類別：自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文 科技發(fā)明制作A類 科技發(fā)明制作B類 說 明1申報(bào)者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說明各項(xiàng)內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2申報(bào)者在填寫申報(bào)作品情況時只需根據(jù)個人項(xiàng)目或集體項(xiàng)目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報(bào)者可根據(jù)情況填寫C表。3表內(nèi)項(xiàng)目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報(bào)書可復(fù)制。4序號、編碼由第十屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽組委會填寫。5學(xué)術(shù)論文、社會調(diào)查報(bào)告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上（文章版面尺寸14.522cm），附于申報(bào)書后，論文不超8000字，調(diào)查報(bào)告不超15000字。6作品申報(bào)書須按要求由各校競賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一寄送。7其他參賽事宜請向本校競賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)咨詢。A2申報(bào)者情況（集體項(xiàng)目）說明：1必須由申報(bào)者本人按要求填寫；2申報(bào)者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為申報(bào)者情況的確認(rèn)。申報(bào)者代表情況姓名謝義涵性別男出生年月1986年12月學(xué)校華南農(nóng)業(yè)大學(xué)系別、專業(yè)、年級05級動物科學(xué)(生物工程方向)學(xué)歷本科學(xué)制4年入學(xué)時間2005年9月作品名稱用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型鴨流感病毒畢業(yè)論文題目雞的傳染性法氏囊GB基因的克隆和序列分析通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510640辦公電話常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山宿舍24棟206郵政編碼510640住宅電他作者情況姓 名性別年齡學(xué)歷所在單位吳永鋒男24本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院周穗婷女23本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院甘燕貞女22本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院李寶紅女21本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院冀君男24本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院資格認(rèn)定學(xué)校學(xué)籍管理部門意見以上作者是否為2009年7月1日前正式注冊在校的全日制非成人教育、非在職的高等學(xué)校中國籍?？粕?、本科生、碩士研究生或博士研究生。是否 （部門簽章）2009年4 月13 日院、系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學(xué)術(shù)科技或社會實(shí)踐活動成果是否負(fù)責(zé)人簽名：2009年4 月13 日B1申報(bào)作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1必須由申報(bào)者本人填寫；2本部分中的科研管理部門簽章視為對申報(bào)者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3作品分類請按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型壓流感病毒作品分類（ D）A機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技術(shù)（包括計(jì)算機(jī)、電信、通訊、電子等） C數(shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等） D生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健 康、衛(wèi)生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化 工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路目的是建立一種快速、簡便、特異、靈敏的適合于基層實(shí)驗(yàn)室使用的H5N1亞型鴨流感病毒的檢測方法?；舅悸?根據(jù)Genbank中注冊的H5N1亞型流感病毒HA基因保守區(qū)的序列，設(shè)計(jì)一組對應(yīng)HA序列6個區(qū)域的4條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，建立RT-LAMP反應(yīng)體系，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件, 擴(kuò)增產(chǎn)物加入核酸染色劑SYBR green，根據(jù)顏色反應(yīng)判斷結(jié)果（檢測結(jié)果：橙黃色為陰性，偏綠色為陽性）；還可以加入焦磷酸離子和溶液中的鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀，根據(jù)反應(yīng)管中濁度的變化判斷結(jié)果，從而建立一種新型的結(jié)果肉眼可視的鑒別鴨流感病毒的方法。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處近兩年來，LAMP方法已廣泛使用與各種病毒的快速檢測。本項(xiàng)目的指導(dǎo)老師謝青梅已建立了鴨瘟的LAMP檢測方法，研究論文發(fā)表在“Research in Veterinary Science”上，該研究具有科學(xué)性和先進(jìn)性。該研究建立的LAMP 方法的優(yōu)點(diǎn):(1)只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)。不需要特殊試劑,不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA 的變性；(2)特異性高；(3)快速、高效擴(kuò)增； (4)步驟簡單 （5）設(shè)備要求簡單，不需要昂貴的PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)；(6)鑒定結(jié)果可用肉眼觀察，適用于基層簡單實(shí)驗(yàn)室使用。這也是本項(xiàng)目的獨(dú)特之處。作品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義為廣大基層養(yǎng)殖戶、畜禽場實(shí)驗(yàn)室建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便的鴨流感病毒的鑒別診斷新方法，快速、及時地完成該疫病的檢測工作。學(xué)術(shù)論文文摘鴨流感的暴發(fā)和流行給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對人類健康造成了嚴(yán)重威脅?？焖僭\斷和及時監(jiān)測是控制流感的首要步驟。本研究建立一種新型、簡便、靈敏且特異的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification Method，RT-LAMP）用于H5亞型鴨流感病毒的檢測。根據(jù)Genbank中注冊的H5N1亞型鴨流感病毒HA基因保守區(qū)的序列，設(shè)計(jì)一組對應(yīng)HA序列6個區(qū)域的4條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，建立RT-LAMP反應(yīng)體系，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為65 保溫60min。反應(yīng)結(jié)果肉眼可見。在擴(kuò)增產(chǎn)物加入焦磷酸離子和溶液中鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀，可見反應(yīng)管中濁度的變化；或者在擴(kuò)增后產(chǎn)物加入核酸染色劑SYBR green，檢測結(jié)果陽性呈綠色，陰性為橙黃色；同時用特異性內(nèi)切酶Kpn進(jìn)行酶切鑒定。用已建立的RTLAMP技術(shù)檢測臨床樣品，檢測結(jié)果與RTPCR方法符合率均達(dá)到100。RT-LAMP技術(shù)整個檢測過程只需12h，不需要貴重的PCR儀和成像系統(tǒng)，僅需要一恒溫水浴鍋即可完成試驗(yàn)。通過特異性、敏感性試驗(yàn)，驗(yàn)證了建立RT-LAMP技術(shù)可以作為一種操作簡單，靈敏性、特異性高的檢測H5亞型鴨流感病毒的技術(shù)，適合于檢驗(yàn)設(shè)備簡陋的生產(chǎn)廠場、基層檢驗(yàn)檢疫單位和防疫部門使用。 作品在何時、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會議上或報(bào)刊上發(fā)表及所獲獎勵2009年“挑戰(zhàn)杯”華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽“特等獎”鑒定結(jié)果請?zhí)峁τ诶斫?、審查、評價(jià)所申報(bào)作品具有參考價(jià)值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄Dukes JP, King DP, Alexandersen S.Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. Arch Virol,2006,(151):1093-1106曾冰冰，肖凱軍，石 磊等. LAMP方法在食品微生物檢測中的應(yīng)用. 現(xiàn)代食品與藥品雜志，2007，17（1）：2225申報(bào)材料清單（申報(bào)論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型鴨流感病毒科研管理部門簽章 年 月 日 C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報(bào)者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。鴨流感是由禽流感病毒引起的一種烈性傳染病, 鴨流感不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展, 而且會影響人類健康。建立快速，敏感，特異的檢測鴨流感病毒的方法對于防控鴨流感有著重要意義。Notomi T等(2000)開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)。其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域, 設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫(65左右)中反應(yīng)1h，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進(jìn)行判斷，日本已利用這種特性研制出專門用于LAMP檢測的實(shí)時監(jiān)控濁度儀,可以實(shí)現(xiàn)對LAMP擴(kuò)增過程的全程實(shí)時監(jiān)控(Manmohan et al，2004；Yasuyoshi et al，2004； Dukes et al，2006)。也有研究者通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果（Dukes et al，2006)。而不需模板熱變性(Nagamine et al，2001)、長時間溫度循環(huán)、凝膠電泳、紫外觀察等過程。目前，國外已有較多的此類報(bào)道，并建立了專門的官方網(wǎng)站。而國內(nèi)起步較晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引進(jìn)LAMP法檢測胚胎的性別(王海浪等，2003)。國內(nèi)外有許多文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)在不同細(xì)菌（Hung et al，2005）及病毒檢測中成功應(yīng)用的實(shí)例，如對西尼羅病毒、SARS病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山藥嵌紋病毒的檢測以及登革病毒的分型等（Hong et al，2004；Manmohan et al，2004；Shiro et al，2004； Manmohan et al，2005； Motoko et al, 2005；J.P.Dukes et al，2006；Ji jun et al,2008）。同時，人們還在不斷對LAMP技術(shù)進(jìn)行改良，使其能在疾病基因診斷、食品分析(曾冰冰等，2007)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域更好地發(fā)揮作用。國外有報(bào)道用RTLAMP技術(shù)檢測人流感H1、H2和H3亞型流感病毒（Leo et al，2005），還用于鑒定流感A、B型的診斷（Masahiro et al，2006）。國內(nèi)還未見用于該方法用于鴨流感病毒的檢測。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1由推薦者本人填寫；2推薦者必須具有高級專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報(bào)作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓 名畢英佐性別男年齡62職稱教授、博導(dǎo)工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510642單位電宅電薦者所在單位簽章畢英佐老師是我校教授、博士生導(dǎo)師。 （簽章）2009 年4月13 日請對申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述該作品是由謝義涵同學(xué)為主的六位同學(xué)共同完成，作品內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價(jià)該作品建立的鴨流感病毒RT-LAMP技術(shù)操作簡單、靈敏性好、特異性高，該方法的檢測靈敏度與熒光定量PCR方法相當(dāng)，適合于檢驗(yàn)設(shè)備簡陋的生產(chǎn)廠場、基層檢驗(yàn)檢疫單位和防疫部門使用，技術(shù)水平高，具有很好的使用價(jià)值和推廣應(yīng)用前景。其它說明推薦者情況姓 名張永亮性別男年齡42職稱教授、博導(dǎo)工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510642單位電宅電話推薦者所在單位簽章張永亮老師是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院院長，動物營養(yǎng)系教授、博士生導(dǎo)師。全國動物生理生化分會副理事長、農(nóng)業(yè)生化與分子生物學(xué)分會理事、吉林省生化與分子生物學(xué)理事、全軍專業(yè)生化委員會委員，中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)編委。 （簽章）2009年4月13 日請對申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述本作品是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科課外科技創(chuàng)新論文，在動物科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室完成，利用了本實(shí)驗(yàn)室成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和已有研究材料，選題具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。謝義涵等六位同學(xué)利用課余時間積極參與本研究室的科研工作，熟悉和掌握了各項(xiàng)基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)。內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價(jià)本作品選題具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，特別對現(xiàn)有鴨流感的快速診斷防治提供了新思路，為基層實(shí)驗(yàn)室提供了一種簡便可靠的檢測鴨流感病毒的新方法。該項(xiàng)目的完成體現(xiàn)了六位同學(xué)具有一定的基因工程實(shí)驗(yàn)技能，對RT-LAMP方法的原理和方法的建立也能較好的掌握。本研究成果對生產(chǎn)實(shí)踐具有很好的理論和實(shí)踐指導(dǎo)作用，有推廣應(yīng)用前景。其它說明學(xué)校組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)確認(rèn)并蓋章 （團(tuán)委代章） 年 月 日 校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門確認(rèn)蓋章 年 月 日E大賽組織委員會秘書處資格和形式審查意見組委會秘書處資格審查意見 審查人（簽名） 年 月 日組委會秘書處形式審查意見 審查人（簽名） 年 月 日組委會秘書處審查結(jié)果合格 不合格 負(fù)責(zé)人（簽名） 年 月 日42用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型鴨流感病毒作者：謝義涵 吳永鋒 周穗婷 甘燕貞 李寶紅 冀 君指導(dǎo)老師：謝青梅副教授作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州，510640【摘要】：鴨流感的暴發(fā)和流行給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對人類健康造成了嚴(yán)重威脅?？焖僭\斷和及時監(jiān)測是控制流感的首要步驟。本研究建立一種新型、簡便、靈敏且特異的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification Method，RT-LAMP）用于H5亞型鴨流感病毒的檢測。根據(jù)Genbank中注冊的H5N1亞型鴨流感病毒HA基因保守區(qū)的序列，設(shè)計(jì)一組對應(yīng)HA序列6個區(qū)域的4條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，建立RT-LAMP反應(yīng)體系，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為65 保溫60min。反應(yīng)結(jié)果肉眼可見。在擴(kuò)增產(chǎn)物加入焦磷酸離子和溶液中鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀，可見反應(yīng)管中濁度的變化；或者在擴(kuò)增后產(chǎn)物加入核酸染色劑SYBR green，檢測結(jié)果陽性呈綠色，陰性為橙黃色；同時用特異性內(nèi)切酶Kpn進(jìn)行酶切鑒定。用已建立的RTLAMP技術(shù)檢測臨床樣品，檢測結(jié)果與RTPCR方法符合率均達(dá)到100。RT-LAMP技術(shù)整個檢測過程只需12h，不需要貴重的PCR儀和成像系統(tǒng)，僅需要一恒溫水浴鍋即可完成試驗(yàn)。通過特異性、敏感性試驗(yàn)，驗(yàn)證了建立RT-LAMP技術(shù)可以作為一種操作簡單，靈敏性、特異性高的檢測H5亞型鴨流感病毒的技術(shù)，適合于檢驗(yàn)設(shè)備簡陋的生產(chǎn)廠場、基層檢驗(yàn)檢疫單位和防疫部門使用?！娟P(guān)鍵詞】：H5亞型鴨流感病毒 HA RT-LAMP【正文】鴨流感是由禽流感病毒引起的一種烈性傳染病, 鴨流感不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展, 而且會影響人類健康。建立快速，敏感，特異的檢測鴨流感病毒的方法對于防控鴨流感有著重要意義。Notomi T等(2000)開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)。其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域, 設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫(65左右)中反應(yīng)1h，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進(jìn)行判斷，日本已利用這種特性研制出專門用于LAMP檢測的實(shí)時監(jiān)控濁度儀,可以實(shí)現(xiàn)對LAMP擴(kuò)增過程的全程實(shí)時監(jiān)控(Manmohan et al，2004；Yasuyoshi et al，2004； Dukes et al，2006)。也有研究者通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果（Dukes et al，2006)。而不需模板熱變性(Nagamine et al，2001)、長時間溫度循環(huán)、凝膠電泳、紫外觀察等過程。目前，國外已有較多的此類報(bào)道，并建立了專門的官方網(wǎng)站。而國內(nèi)起步較晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引進(jìn)LAMP法檢測胚胎的性別(王海浪等，2003)。國內(nèi)外有許多文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)在不同細(xì)菌（Hung et al，2005）及病毒檢測中成功應(yīng)用的實(shí)例，如對西尼羅病毒、SARS病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山藥嵌紋病毒的檢測以及登革病毒的分型等（Hong et al，2004；Manmohan et al，2004；Shiro et al，2004； Manmohan et al，2005； Motoko et al, 2005；J.P.Dukes et al，2006）。同時，人們還在不斷對LAMP技術(shù)進(jìn)行改良，使其能在疾病基因診斷、食品分析(曾冰冰等，2007)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域更好地發(fā)揮作用。國內(nèi)還未見用于流感病毒的檢測。國外有報(bào)道用RTLAMP技術(shù)檢測人流感H1、H2和H3亞型流感病毒（Leo et al，2005），還用于鑒定流感A、B型的診斷（Masahiro et al，2006）。LAMP法具有許多迄今為止的擴(kuò)增方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)：（1）只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)。不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性。（2）高特異性:應(yīng)用六個區(qū)段，四條引物，并且這六個區(qū)段的順序也有規(guī)定。原理上LAMP法擴(kuò)增的特異性很高，因此可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否,即能夠進(jìn)行細(xì)菌或病毒的定性檢測。（3）快速、高效擴(kuò)增:整個擴(kuò)增在不到1h即可完成，且產(chǎn)率可達(dá)到0.15mg/ml。為提高LAMP反應(yīng)的速度，Nagamine等（2002）通過2條環(huán)狀引物加快LAMP的反應(yīng)，使反應(yīng)時間比原來縮短近一半，提高了檢測效率。（4）靈敏度高：擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝。（5）步驟簡單：擴(kuò)增RNA只要在DNA基因擴(kuò)增試劑的基礎(chǔ)上加上逆轉(zhuǎn)錄酶，就能夠完全像DNA基因擴(kuò)增那樣，一步實(shí)現(xiàn)RNA擴(kuò)增（Hiroko et al，2006；H. Soliman et al，2006；Kazuya et al，2007），反應(yīng)不需PCR儀和特殊試劑。（6）鑒定簡便：在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀它有極高的特異性,只要用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。本文優(yōu)化了RT-LAMP技術(shù)檢測鴨流感病毒的反應(yīng)條件，并驗(yàn)證了準(zhǔn)確性獲得一種檢測H5亞型鴨流感病毒的有效快速的可靠方法。1、材料和方法1.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP)的實(shí)驗(yàn)原理環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP) 是對靶基因的6 個特異部位設(shè)定4 種引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴(kuò)增。LAMP反應(yīng)所用到的引物，設(shè)計(jì)起來比較復(fù)雜，而且是實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的關(guān)鍵所在。引物總共有四條，內(nèi)外引物各兩條。如圖1所示，上游的內(nèi)引物FIP (Forward Inner Primer )由F1c（F1的互補(bǔ)序列） 、F2和TTTT連接子組成；下游的內(nèi)引物BIP（Backward Inner Primer）由B1c（B1的互補(bǔ)序列）、B2和TTTT連接子組成；上游的外引物F3（Forward Outer Primer）和下游的外引物B3（Backward Outer Prime）分別為F3c和B3c的互補(bǔ)序列。圖1 靶序列上的6段區(qū)域及四種特異性引物各區(qū)段的引物設(shè)計(jì)規(guī)則與PCR相同。設(shè)計(jì)時應(yīng)注意堿基的構(gòu)成、GC含量、二聚體結(jié)構(gòu)、引物序列的長度、引物與引物間的距離、Tm值（用毗鄰法求得）、3末端不可出現(xiàn)富AT結(jié)構(gòu)等，此外擴(kuò)增的區(qū)段最好控制在300bp以內(nèi)。每條引物的長度控制在1726nt之間；GC含量最好控制在4050之間；F1c和B1c的Tm值大約為6466，F(xiàn)2、B2、F3、B3的Tm值大約為5961；F2與B2的5端相距120180bp，F(xiàn)2與F3、B2與B3相距020bp。LAMP反應(yīng)原理:（1）內(nèi)引物 FIP首先和 F2c結(jié)合，具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶將一條單鏈的DNA置換下來。（2）結(jié)合到DNA鏈上的FIP引物啟動互補(bǔ)鏈的合成，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。（3）F3再和 F3c結(jié)合，啟動鏈置換反應(yīng)，釋放出 1條FIP連接的互補(bǔ)鏈，在其一端能夠形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。（4）F3引物結(jié)合到靶DNA上形成雙鏈DNA。（5）釋放出的1條FIP連接的互補(bǔ)鏈，在其一端能夠形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。（6）在步驟（5）中形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈可作為模板，在另一端結(jié)合 BIP和 B3合成 1條雙鏈。（7）B3引物結(jié)合到步驟（5）形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈中，形成雙鏈DNA，并置換出1條FIP和BIP連接的互補(bǔ)鏈。（8）在步驟（6）中置換出的互補(bǔ)鏈，在其兩端均形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，形成啞鈴狀的DNA。不過啞鈴結(jié)構(gòu)很快與其一端F1c和F1互補(bǔ)，而由自我引物延伸機(jī)制合成1種雙鏈的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA是循環(huán)反應(yīng)的原料。循環(huán)反應(yīng)中(9-11)，首先 FIP和雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合成1種有缺口的過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，該結(jié)構(gòu)在莖上含有靶序列的1個額外反向復(fù)制序列，在對面的末端，通過 BIP形成 1個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在隨后的自我引物置換延伸合成過程中，在內(nèi)引物作用下，開始循環(huán)反應(yīng)，莖的長度和環(huán)的個數(shù)都逐漸增加，最后的產(chǎn)物為莖環(huán)DNA組成的混合物，即含有若干倍莖長度莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)(含有在同一鏈上由退火形成的，在靶序列的交替反向重復(fù)序列之間的多重環(huán)狀結(jié)構(gòu))。其結(jié)果可以利用加SYBR Green熒光染料后顏色變化或焦磷酸鎂濁度變化來判斷，可以直接通過肉眼觀察來判斷擴(kuò)增與否。1.2 病毒鴨流感病毒株（A/duck/PT/2008(H5N1)；所有與病毒有關(guān)的試驗(yàn)均在廣東溫氏食品集團(tuán)P3實(shí)驗(yàn)室完成。1.3 常用試劑AMV 反轉(zhuǎn)錄酶（5U/ul）、HRP RNA 酶抑制劑（40U/ul）及相應(yīng)緩沖液，dNTPs（2.5mM each）、DNA Marker DL2000為TaKaRa產(chǎn)品。Bst DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品。RNA提取試劑TRIzol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品。DEPC和飽和酚購自上海生工生物工程公司；氨芐青霉素、鏈霉素、溴化乙錠（EB）購自寶泰克生物科技有限公司；瓊脂糖購自基因有限公司。1.4 主要儀器及設(shè)備PCR Express Gradient PCR儀，法國HYBAID公司水浴鍋，上海一恒科技有限公司。1.5 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank上公布的H5亞型鴨AIV HA基因序列，比對后選取保守區(qū)域，用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)兩條外引物（F3、B3）和兩條內(nèi)引物（FIP、BIP，引物FIP由F1c、F2和TTTT連接子組成，引物BIP由B1c、B2和TTTT連接子組成）。引物序列：F3：5-GCCATTCCACAACATACACCC-3FIP：5-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTG-TTTT-TCTCACCATCGGGGAATGCC-3BIP：5-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGG-TTTT-GTATCCACTCCCCTGCTCATTGC-3B3：5-TGGTGACTCCATCTATTGCCT-3引物在靶序列H5亞型鴨AIV HA基因保守區(qū)序列中的對應(yīng)位置：（下劃線加粗部分為各引物序列，加粗邊框部分為Kpn酶切位點(diǎn)）： F3F2 5-GCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGA-33-CGGTAAGGTGTTGTATGTGGGAGAGTGGTAGCCCCTTACGGGGTTTATACACTTTAGTTTGTCT-55-TTAGTCCTTGCGACTGGACTCAGAAATACCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGAC-33-AATCAGGAACGCTGACCTGAGTCTTTATGGGGAGTTTCTCTCTCTTCTTCTTTTTTCTCTCCTG-5F1c B1c 5-TATTTGGAGCTATAGCAGGGTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGG-33-ATAAACCTCGATATCGTCCCAAATATCTCCCTCCTACCGTCCCTTACCATCTACCAACCATACC-55-GTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGATACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGC-33-CATGGTGGTATCGTTACTCGTCCCCTCACCTATGCGACGTCTGTTTCTTAGGTGAGTTTTCCGT-5B25-ATAGATGGAGTCACCA-33- TATCTACCTCAGTGGT-5B31.6 RT-LAMP方法的建立1.6.1 病毒的繁殖將H5N1 亞型鴨流感病毒用滅菌的生理鹽水分別以500倍稀釋后，以尿囊腔途徑接種11日齡SPF雞胚，0.2 ml/胚，在37恒溫箱繼續(xù)孵育，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，無菌收獲24-72h內(nèi)感染胚尿囊液，用雞紅細(xì)胞測定其血凝效價(jià)，-80保存?zhèn)溆谩?.6.2 病毒RNA的提取按Invitrogen公司TRIzol LS Reagent RNA提取試劑盒的使用說明書進(jìn)行。在1.5 mL微量離心管中加入250 L病毒尿囊液和750 L TRIzol，充分混勻，室溫放置10 min；加入200 L氯仿，激烈搖動15 sec，室溫靜置5 min后，412 000 r/m離心15 min；取上清液于一新的滅菌1.5 mL微量離心管，加500 L異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min，412 000 r/m離心10 min；棄去上清液，沉淀用70%乙醇750 L，輕輕混勻，洗滌1次，412 000 r/m離心10 min；棄去上清，風(fēng)干；用10 L經(jīng)DEPC處理的無RNA酶的三蒸水溶解沉淀，直接用于RT-LAMP或-80保存?zhèn)溆谩?.6.3 H5N1亞型鴨流感病毒HA基因保守區(qū)的LAMP擴(kuò)增分別用Lamp引物以抽提的RNA為模板，擴(kuò)增H5N1亞型病毒的HA基因片段，25L LAMP反應(yīng)體系的組成為（設(shè)陰性對照）： 10buffer2.5 LdNTPs（2.5mM）4 LRNA1 LFIP（10M）2 LBIP（10M）2 LF3（10M）0.5LB3（10M）0.5LBst DNA聚合酶1 LddH2O12.5 L環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)在水浴中進(jìn)行。反應(yīng)條件為：65 1h，80 10min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL的溴化乙錠）電泳檢測，電泳條件為80V、30 min。用VL凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。1.6.4 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定在25L反應(yīng)體系中加入以下組分：10buffer2 LKpn酶1 LH5的擴(kuò)增產(chǎn)物 5 LddH2O12 L總體積25L將上述反應(yīng)物混勻離心后，37反應(yīng)2h。反應(yīng)后取5L反應(yīng)液，用2%瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL EB）電泳對酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。1.7 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化（1） 不同反應(yīng)時間在25L反應(yīng)體系中加入同1.6.3步驟的混合物，設(shè)陰性對照，混勻離心后，將反應(yīng)物放在65水浴鍋中，分別在反應(yīng)后10min、30min、40min、60min后取出。待反應(yīng)產(chǎn)物全部取出后，取5L反應(yīng)液，用2%瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL EB）電泳對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。（2）不同反應(yīng)溫度同樣，在25L反應(yīng)體系中加入反應(yīng)混合物，設(shè)陰性對照，混勻離心后，將反應(yīng)物分別放在55、60、65水浴鍋中反應(yīng)1h，80 10min。反應(yīng)后取5L反應(yīng)液，用2%瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL EB）電泳對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。1.8 特異性試驗(yàn) 分別提取NDV（雞新城疫病毒）、IBV（雞傳染性支氣管炎病毒）、H5亞型AIV的核酸，用H5 lamp引物進(jìn)行RTLAMP檢測。1.9 靈敏度試驗(yàn)將抽提出的病毒RNA進(jìn)行10倍遞進(jìn)稀釋后作為RTLAMP反應(yīng)的模板，反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。1.10 陽性樣品的RTLAMP檢測對3份H5亞型鴨AIV陽性樣品進(jìn)行了RTLAMP檢測。1.11 酶切鑒定和可視化結(jié)果 在20L反應(yīng)體系中加入以下組分：10buffer 2 L, Kpn酶 1 L, H5 AIV的擴(kuò)增產(chǎn)物 5 L, ddH2O 12 L,上述反應(yīng)物混勻離心后，37反應(yīng)4h。反應(yīng)后取5 L反應(yīng)液，用Kpn對H5亞型病毒LAMP產(chǎn)物進(jìn)行消化，用2%瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL EB）電泳對酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。選擇一陽性管在反應(yīng)前另加入SYBR Green I 染料或 4mM Mg2+，反應(yīng)結(jié)束后觀察陽性管與對照管的差異。1.12 H5亞型鴨AIV待測樣品的RT-LAMP與RTPCR檢測方法比較用本研究建立的RTLAMP技術(shù)檢測臨床樣品6份，RTPCR方法按傳統(tǒng)步驟進(jìn)行。2 結(jié)果與分析 2.1最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化 本試驗(yàn)設(shè)定了55、60、65三個反應(yīng)溫度；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這三種溫度條件下均能進(jìn)行LAMP反應(yīng)，但是，不同溫度條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物的含量有差異；這表明，Bst DNA聚合酶在不同溫度下活性大小不同，在65下，活性最大，而在55時，反應(yīng)活性較小。因此，反應(yīng)在5065范圍內(nèi)均可發(fā)生反應(yīng)，而反應(yīng)最佳溫度為65。以65為反應(yīng)溫度，分別在30min60min時間內(nèi)不同時間段進(jìn)行LAMP反應(yīng)終產(chǎn)物的電泳檢測。圖中所見，在反應(yīng)20min后，可見明顯的梯狀條帶，反應(yīng)30min60min后梯狀條帶逐漸變亮，在反應(yīng)60min后，梯狀條帶表現(xiàn)最明顯。因此，RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的最佳時間為60mim。圖1 不同反應(yīng)溫度條件下H5亞型鴨AIV RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；13分別為在65、60、55條件下H5亞型基因的RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物， 4為陰性對照；圖2 不同反應(yīng)時間下H5亞型鴨AIV RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；，14分別為反應(yīng)60min、40min、30min、20min后的LAMP擴(kuò)增結(jié)果，5為陰性對照22 RT-LAMP的靈敏性、特異性測定 用H5 lamp引物分別對H5 鴨AIV、NDV、IBDV、IBV和H9 AIV進(jìn)行 RTLAMP檢測，結(jié)果顯示：本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的H5 lamp引物具有高度的特異性，只有針對H5亞型鴨AIV才出現(xiàn)目的條帶，其它病毒均不擴(kuò)增，如圖3。將抽提出來的RNA產(chǎn)物進(jìn)行10倍遞進(jìn)稀釋至10-7，進(jìn)行RTLAMP反應(yīng)，即使在很低拷貝的模板RNA存在時（10-7）， 仍有微弱的產(chǎn)物帶，并且可以在紫外燈下進(jìn)行對比（圖4），可檢測到的濃度最低為1ng/ml。圖 3 H5亞型RT-LAMP檢測的特異性試驗(yàn)M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；4為H5亞型AIV的陽性結(jié)果，1，2、3，5分別為H9亞型AIV，NDV，IBDV及IBV的陰性結(jié)果；6為陰性對照圖4 H5亞型RT-LAMP檢測的靈敏度試驗(yàn)上圖M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；下圖為加入核酸染料SYBR green后在紫外燈照射下的可視結(jié)果。1為陰性對照，27為產(chǎn)物稀釋至10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2倍的結(jié)果；23 RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定和可視鑒別 理論計(jì)算中， H5亞型擴(kuò)增終產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶Kpn消化后，應(yīng)成為兩條大小分別為76bp和140bp的主帶以及少量其它大小不同的條帶，圖5結(jié)果與理論值完全相符。圖6顯示了在自然光下LAMP的擴(kuò)增結(jié)果，可見陽性管的反應(yīng)液已明顯混濁，這是因?yàn)閿U(kuò)增后形成的焦磷酸離子和溶液中的鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀所致。圖7顯示RT-LAMP陽性擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I 染料可見綠色熒光（管2）。圖5 RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1為LAMP擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶Kpn消化后的結(jié)果；2為LAMP擴(kuò)增后產(chǎn)物；圖6為H5亞型AIV RT-LAMP產(chǎn)物形成焦磷酸鎂沉淀的可視結(jié)果1為陰性對照管，2為RT-LAMP陽性擴(kuò)增管，有白色沉淀出現(xiàn)。1 2 B 圖7為H5亞型AIV RT-LAMP產(chǎn)物加入SYBR Green I 染料可視結(jié)果：1為陰性結(jié)果，2為陽性結(jié)果。2.4 H5亞型AIV待測樣品的RT-LAMP與RTPCR檢測方法比較用已建立的RTLAMP技術(shù)檢測臨床樣品，檢測臨床樣品結(jié)果與RTPCR方法結(jié)果一致，如圖8。陰性 對照1 2 3 4 5 6 M圖8 待測樣品的RT-LAMP和RT-PCR檢測M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 2、3、5樣品經(jīng)RT-LAMP和RT-PCR檢測均為陽性；1、4、6為陰性。3 討論世界上最早于1952年由Walker等從加拿大商品鴨中分離到鴨流感（AIV），但未鑒定其亞型。水禽不僅是鴨流感病毒的巨大貯存庫，且其本身已成為對鴨流感病毒高度易感的自然感染發(fā)病、死亡的禽類。檢測水禽群體中是否存在流感病毒存在，采取相應(yīng)預(yù)防與干預(yù)措施，對整體控制鴨流感病毒有著重要的意義。根據(jù)上述結(jié)果，本研究建立的H5亞型鴨流感病毒RT-LAMP快速檢測技術(shù)具有靈敏、簡便、特異性高及結(jié)果可視鑒別的優(yōu)點(diǎn)，有利于診斷與控制此病。由于RNA酶在環(huán)境中的廣泛存在，RNA很容易降解。這在核酸檢測中，使得RNA比DNA在靈敏性上有所限制，傳統(tǒng)RT-PCR中，反轉(zhuǎn)錄過程需要將近一小時時間，有文獻(xiàn)證明LAMP比PCR更靈敏(Gunimaladevi et al.,2005; Kono et al., 2005; Savan et al.,2004)，只需要很低的拷貝數(shù)就可進(jìn)行擴(kuò)增，所以在RT-LAMP反應(yīng)過程中，反轉(zhuǎn)錄的時間只設(shè)定為10min就已經(jīng)足夠，這又縮短了檢測時間，在保證高靈敏度的同時，能夠快速獲得診斷結(jié)果。RT-LAMP反應(yīng)過程中有副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生，使陽性反應(yīng)管有明顯的變渾濁現(xiàn)象，同時大量的擴(kuò)增產(chǎn)物在結(jié)合核酸染色劑SYBR 的情況下，有肉眼可見的顏色變化(Soliman, et al.,2005)（陰性為橙黃色，陽性偏綠色），雖然僅靠這些判斷并不準(zhǔn)確，不能排除非特異性擴(kuò)增，但結(jié)果的可視觀察，可以脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制，加上擴(kuò)增是等溫進(jìn)行，不用依賴PCR儀復(fù)雜的循環(huán)溫度變化，在水浴鍋中就能進(jìn)行，這些都使該技術(shù)在小型研究所、衛(wèi)生站有更廣闊的應(yīng)用前景。LAMP的高靈敏性同時會增大反應(yīng)假陽性的幾率，在檢測過程中要進(jìn)行物理分區(qū)，核酸抽提、核酸擴(kuò)增以及產(chǎn)物電泳都應(yīng)分別在獨(dú)立的環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)楫a(chǎn)物電泳圖為梯狀拖帶圖樣，一旦出現(xiàn)非特異應(yīng)擴(kuò)增不易察覺，所以用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定就十分必要。今年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)所需要的BST聚合酶對血液、細(xì)胞培養(yǎng)液等各種物質(zhì)表現(xiàn)出比Taq聚合酶更高的耐受性（Kaneko,et al.,2007），對于DNA的檢測來說，核酸抽提或許能省略就能達(dá)到檢測的目的，這是一個很閃光的優(yōu)點(diǎn)?？傊?，RT-LAMP作為一種便捷、高特異性、高靈敏度的新型核酸擴(kuò)增方法，隨著方法的不斷發(fā)展與改進(jìn)，必將會在分子生物學(xué)特別是傳染病的病原診斷方面發(fā)揮重要作用 【參考文獻(xiàn)】：1甘孟侯, 鄭世軍. 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