總菌數(shù)測定1.doc

細(xì)菌總數(shù)的測定（1）培養(yǎng)計數(shù)法一、目的1.掌握從微生物群體中土壤和飼料等）獲得純種微生物的分離和培養(yǎng)技術(shù)。2.掌握無菌操作技術(shù)。二、材料和器皿1. 天平、取樣工具、涂布棒(接種棒)。 2. 無菌三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、移液管、玻璃珠。 3. 無菌水。 4. 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)操作步驟1、取樣 將待測樣品充分混勻，取少量，備用。2、 倒平板 熔化已滅菌的上述4種培養(yǎng)基并冷卻至45oC左右倒平板，凝固待用，每種培養(yǎng)基每個稀釋度各三只平板。3、編號 取5支無菌空試管（15150mm）依次編號為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分裝無菌水 按無菌操作用5mL移液管分別吸取4.5mL無菌水于編號的各無菌空試管中。5. 制備土壤稀釋液 稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩1020min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液。用無菌移液管吸取懸液0.5mL于4.5mL無菌水試管中，用移液管吹吸三次、搖勻，此即為10-3濃度。同樣方法，依次稀釋到10-7。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進(jìn)行。環(huán)境要求：瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。代表性：取固體樣品時需多采幾個部位，且經(jīng)過均質(zhì)或研磨；液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。 減少誤差：每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管，將吸管內(nèi)液體沿管壁流入， 勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，并且稀釋液應(yīng)充分振搖。6、 培養(yǎng)及計數(shù)計數(shù)時間：到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不得超過24h。計平皿中菌落數(shù)：肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。記下各平板的菌落總數(shù)，求出同稀 釋度的各平板平均菌落數(shù)。規(guī)律：不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)；當(dāng)計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。計數(shù)原則：選平均菌落數(shù)在30300之間者進(jìn)行計算1.僅1個稀釋度的平均菌落數(shù)在此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報 告之。2.若有2個稀釋度的平均菌落數(shù)在30300之間時，則按兩者的菌落總數(shù)之比來決 定，若比值小于2應(yīng)報告兩者的平均數(shù)；若大于2則報告其中較小的菌落總數(shù)。3.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，以稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)報告之。4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀 釋倍數(shù)報告之。5.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最接近300或30的平均菌 落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。6. 若所有的菌落數(shù)勻?yàn)椤盁o法計數(shù)”時，應(yīng)注明水樣的最大稀釋倍數(shù)。7在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中1個平板上有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落約為平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上的菌落計數(shù)，然后乘以2作為整個平板的菌落數(shù)。7、 菌落總數(shù)報告方式菌落數(shù)的報告，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1100時，按實(shí)有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。為了縮短數(shù)字后面的零位，可用10的指數(shù)來表示。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（mL）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。8. 計數(shù) 選菌落分散、菌落數(shù)適量且各平行皿菌落數(shù)接近的稀釋度的平皿計數(shù)，通常細(xì)菌和放線菌選取菌落數(shù)在30300之間的平皿，霉菌選菌落數(shù)在10100之間的平皿，最后換算成每克待測干樣品所含菌數(shù)。 同一稀釋度的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)每克樣品含菌數(shù) = 1樣品含水量(2) 直接鏡檢法一、目的要求1、明確血球計數(shù)板計數(shù)的原理2、掌握測定細(xì)胞總數(shù)、活菌數(shù)百分率的技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理鏡檢計數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球計數(shù)板；一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤(Petroff Hausser)細(xì)菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故細(xì)菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網(wǎng)。每個方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格(又稱為計數(shù)室)常被用作微生物的計數(shù)。計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點(diǎn)，即每個大方格都由400個小方格組成。每個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為l4000mm3。使用血球計數(shù)板直接計數(shù)時，先要測定每個小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。 血球計數(shù)扳的構(gòu)造血球計數(shù)板計數(shù)網(wǎng)的分區(qū)和分格三、實(shí)驗(yàn)器材待測菌懸液，顯微鏡，血球計數(shù)板，載玻片，電吹風(fēng)，蓋玻片，接種環(huán)，0.1%呂氏美藍(lán)染色液。四、方法步驟1、菌懸液的制備為便于計數(shù)，對樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，稀釋程度以每小格內(nèi)含5-10個為宜，可采用10倍系列稀釋法。對于固體待測物，取10g放入盛有90ml無菌水的三角瓶中，充分震蕩20分鐘，使待測物與水充分混合，此為待測物10-1懸液，吸取1ml此懸液，置于9ml無菌水中，另用無菌吸管吹吸3次混勻，此為10-2懸液，以此類推。2、鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進(jìn)行鏡檢。如有污物，則需清洗，用點(diǎn)吹風(fēng)吹干后才能進(jìn)行計數(shù)。3、加樣品將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的菌懸液由蓋玻片邊緣讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動進(jìn)入計數(shù)室，用吸水紙吸去多余菌液。樣品要均勻充滿計數(shù)室，不可有氣泡。4、顯微鏡計數(shù)加樣后靜止5min，然后將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍物鏡尋找計數(shù)室的位置，然后換成高倍物鏡（40倍）進(jìn)行計數(shù)。顯微鏡視野中的光線要暗一些，否則，不容易看清計數(shù)室的方格線。計數(shù)時，對位于線上的細(xì)菌，可采取只計數(shù)兩條邊的辦法，即遵循查上不查下，查左不查右的原則。當(dāng)芽體達(dá)到母細(xì)胞大小1/2時，即可計作兩個細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)（mL）=80小格內(nèi)酵母菌細(xì)胞數(shù)/8040010000稀釋倍數(shù)=4na106式中 n稀釋倍數(shù) A平均每個中格細(xì)胞數(shù)5、活菌數(shù)的測定 滴一滴0.1%呂氏美藍(lán)液于載玻片中央，再用接種環(huán)取菌液