包涵體純化方案

包涵體純化方案緩沖液配方：1. 變性復(fù)性緩沖液精品資料緩沖液a：50mmtris-hcl(ph8.5),1mmedta, 100mmnacl,1%tritonx-100緩沖液 b：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl，1%triton x-100 ，2m 脲素緩沖液 c：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl，1%triton x-100緩沖液 d：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl，1%triton x-100 ，2m 鹽酸胍溶解緩沖液e：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl， 10mm-巰基乙醇 /dtt， 2mm 脫氧膽酸鈉， 8m 脲素復(fù)性緩沖液： 50mm tris-hcl (ph8.5)，100mm nacl，6m/4m/2m脲素,1% 甘氨酸，5% 甘油，0.2%peg，1mm 氧化型谷胱甘肽，1mm 還 原型谷胱甘肽2. 純化緩沖液binding buffer ： 50mm tris-hcl, 100mm nacl, 10mm咪 唑 ， ph8.5 elution buffer ：50mm tris-hcl, 100mm nacl,不同濃度梯度咪唑 , ph8.5具體實(shí)施步驟：1. 大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌液7000rpm 離心 10min 。棄上清，用 1pbs 重懸，洗滌菌體細(xì)胞， 7000rpm ，離心 10min 。再用 pbs 重復(fù)洗一遍。離心后留菌體沉淀。2.將菌體細(xì)胞用緩沖液a 重懸，液氮中反復(fù)凍融后，超聲破碎。13000rpm離心10min ，棄上清，收集包涵體沉淀。2. 分別用緩沖液b、c、d 超聲清洗包涵體沉淀。13000rpm離心 10min 收集沉淀。3. 用緩沖液e溶解包涵體，緩慢搖動使其緩慢溶解，室溫放置30min ，然后13000rpm離心 10min 。取上清。4. 將上清稀釋至0.1-1.0mg/ml ，裝入透析袋中，放置于梯度復(fù)性緩沖液中，4 緩慢透析 24-36h 。最后在純化binding buffer中透析，確保蛋白穩(wěn)定可溶。5. 對溶解的包涵體蛋白進(jìn)行親和層析。附注：edta 防止蛋白降解 nacl 一定的鹽離子可降低某些帶電基團(tuán)間的斥力triton x-100除去其他細(xì)菌成分，如膜外蛋白，質(zhì)粒dna 和其他雜質(zhì)脲素，鹽酸胍，洗掉包涵體表面的不溶性雜蛋白 -巰基乙醇 /dtt 作為還原劑打開錯配的二硫鍵脫氧膽酸鈉作為離子型去垢劑能促溶蛋白 甘氨酸、甘油促溶peg 可逆修飾折疊中間體的疏水基團(tuán)氧化型和還原型谷胱甘肽促進(jìn)二硫鍵的