第六章-工業(yè)微生物育種.ppt

第六章工業(yè)微生物誘變育種,誘變育種,是指利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變頻率顯著提高的基礎(chǔ)上，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株，以供科學(xué)實驗或生產(chǎn)實踐使用。,效價：指有效成分的濃度。1ug/ul稱為1單位,從青霉素產(chǎn)量看誘變育種,誘變育種目的,提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量改變菌種特性，提高產(chǎn)品質(zhì)量簡化工藝條件開發(fā)新品種,誘變育種的過程,選擇合適的出發(fā)菌株制備待處理的菌懸液誘變處理篩選保藏和擴(kuò)大試驗,一、誘變育種的實驗準(zhǔn)備,（一）誘變前對出發(fā)菌株的了解1、區(qū)分不同菌落類型2、出現(xiàn)不同菌落類型原因,（二）全面了解菌種特性和生產(chǎn)性能的關(guān)系（三）了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素1、培養(yǎng)基2、斜面培養(yǎng)基的制備技術(shù)3、接種量4、溫度5、濕度6、藥品和原材料質(zhì)量,（四）了解菌種有效產(chǎn)物中的各種組分在代謝合成過程中與培養(yǎng)條件的關(guān)系（五）建立一個準(zhǔn)確、簡便、快速檢測產(chǎn)物的方法（六）研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,二、誘變育種的步驟及方法,（一）選擇合適的出發(fā)菌株1、對一般菌株的要求野生菌株對誘變劑敏感最好選用來自生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株。具有有利性狀（如高產(chǎn)、生長速度快、營養(yǎng)要求粗放、標(biāo)記明顯等）；可選用已發(fā)生過其他突變的菌株。,2、選擇具有一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株作為出發(fā)菌株3、選擇純種做出發(fā)菌株4、選擇出發(fā)菌株應(yīng)考慮其穩(wěn)定性5、連續(xù)誘變育種過程中如何選擇出發(fā)菌株6、采用多出發(fā)菌株7、了解菌種代謝特點,（三）制備待處理的菌懸液,1、選用單細(xì)胞或單孢子懸液（均勻、分散）目的：使每個細(xì)胞能均勻接觸誘變劑；減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象）同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）菌齡：對誘變劑最敏感時期營養(yǎng)細(xì)胞：對數(shù)期孢子或芽孢：萌發(fā)前期,菌懸液的制備方法物理誘變：生理鹽水配制化學(xué)誘變：緩沖液配制菌懸液的濃度酵母菌，霉菌的孢子：106個/mL細(xì)菌，放線菌孢子：108個/mL不產(chǎn)孢子真菌：采用幼齡菌絲，三種方法制。制備原生質(zhì)體作為誘變材料。,誘變劑的選擇（高效，簡便）,物理誘變劑：頻度低、大損傷，難修復(fù)，且操作簡便；化學(xué)誘變劑：頻度高，點突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。(NTG超誘變劑）,UV是最常用的一種誘變劑,（四）誘變劑的選擇及處理方法,2、根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑3、參考出發(fā)菌株原有的誘變譜系來選擇誘變劑,常以殺菌率來表示相對劑量（劑量-存活率曲線）最適劑量：既能擴(kuò)大變異幅度，又能使變異向正突變范圍移動的劑量。(P103)突變率隨劑量的增加而提高，達(dá)一定程度后，再提高劑量,反而會使突變率下降。正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。常采用相對殺菌率為70-75%。,4.劑量的選擇,（五）誘變處理方法,單因素處理或多因素的復(fù)合處理：同一誘變劑的重復(fù)使用；兩種或多種誘變劑的先后使用；兩種或多種誘變劑的同時使用；紫外線光復(fù)活交替處理誘變劑處理時間與誘變效應(yīng)的關(guān)系,（六）影響突變率的因素1、菌種遺傳特性不同2、菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同3、環(huán)境條件的影響1）誘變前預(yù)培養(yǎng)2）溫度、pH、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響3）菌落密度效應(yīng),表型延遲（phenotypiclag）：表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象.分離性延遲：突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。生理性延遲：由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能表現(xiàn)出來。,分離性延遲的原因:對數(shù)生長期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，誘變對數(shù)期的細(xì)胞時，突變通常發(fā)生在一個核上，故其變異或非變異的細(xì)胞必須經(jīng)過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細(xì)胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。,生理性延遲的原因:當(dāng)變異細(xì)胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時,由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經(jīng)過細(xì)胞多代分離后,才能將這些非變異的酶稀釋掉,最終達(dá)到變異后應(yīng)該表現(xiàn)的形態(tài),如營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。,（四）中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）,目的：克服表型延遲,初篩復(fù)篩,1.初篩（以量為主）,（1）利用形態(tài)變異：需預(yù)先測定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性,（2）根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；抑菌圈法（抗生素）；變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產(chǎn)量高低（初篩指標(biāo)）,方法需簡便、快速,2步,（五）突變株的篩選,（3）濃度梯度法（4）影印平板法（5）瓊脂塊大通量篩選方法,2.復(fù)篩（以質(zhì)為主，定量測定）（1）搖瓶培養(yǎng)，直接檢測所需產(chǎn)物（2）產(chǎn)物活性檢查瓊脂平板活性圈法紙片法瓊脂薄層紙片法（3）復(fù)篩數(shù)據(jù)的調(diào)整菌落、菌體形態(tài)觀察進(jìn)一步篩選突變株；培養(yǎng)基和條件的調(diào)整；菌株純度及遺傳特性進(jìn)行研究,二、誘變育種的基本原則,選擇簡便有效的誘變劑；挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株；處理單細(xì)胞或單孢子懸液；選用最適的誘變劑量；充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)；利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)；設(shè)計高效篩選方案；創(chuàng)造新型篩選方法。,1.抗性突變株的篩選(1)抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選用途：篩選相應(yīng)代謝物的高產(chǎn)菌株,三、幾種重要突變株的篩選方法,結(jié)構(gòu)類似物（又稱代謝拮抗物）是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物（氨基酸、嘌呤、維生素等）相似的物質(zhì)。如：異煙肼（“雷米封”）是吡哆醇的結(jié)構(gòu)類似物，利用含異煙肼梯度平板篩選異煙肼抗性突變株，可達(dá)到定向培育吡哆醇高產(chǎn)突變株的目的。,（2）抗藥性突變株用途：篩選相應(yīng)藥物(抗生素)的高產(chǎn)菌株或遺傳標(biāo)記制作篩選的方法:a.高于臨界濃度的平板進(jìn)行分離；b.梯度平板法,敏感菌苔,抗性菌落,加入含異煙肼的上層,加入不含異煙肼的底層,（1）幾個概念：,基本培養(yǎng)基（MM）-：某野生型能生長的最低成分的組合培養(yǎng)基。,完全培養(yǎng)基（CM）+：各種營養(yǎng)缺陷型能生長的天然或半組合培養(yǎng)基,補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）A:-+A，B:-+B相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型能生長的組合或半組合培養(yǎng)基,2.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選,三種遺傳型：,野生型（wildtype）從自然界分離到的、發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。A+B+,可在-生長。,營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變菌株（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。A+B-：能在+、B生長A-B+：能在+、A生長A-B-：能在+生長,原養(yǎng)型（prototroph）營養(yǎng)缺陷型經(jīng)回復(fù)突變或重組，回到原來野生型的營養(yǎng)要求A+B+,可在-生長,（2）篩選步驟（5步）,誘變處理,中間培養(yǎng),淘汰野生型,檢出缺陷型,鑒定缺陷型,中間培養(yǎng),CM或SM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。克服表型延遲。,淘汰野生型,即濃縮缺陷型，以提高檢出率,饑餓培養(yǎng)（無N）MM612h2N培養(yǎng)(2N)MM12h加抗生素(或菌絲過濾)，培養(yǎng)過夜,抗生素法（G+細(xì)菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）菌絲過濾法（絲狀真菌、放線菌）,方法,營養(yǎng)缺陷型的檢出,方法,逐個檢出法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法影印平板法,營養(yǎng)缺陷型的鑒定,分兩步：,a.三大類營養(yǎng)要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定b.具體到某一種營養(yǎng)要求的鑒定(哪一種氨基酸,哪一種維生素,或哪一種堿基),具體操作:一般采用“濾紙片法”,生長譜法：快速，直觀,a.不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液b.維生素混合液c.0.1%堿水解酵母核酸液,a,b,c,三大類營養(yǎng)要求的鑒定,以氨基酸缺陷為例進(jìn)行說明將21種氨基酸按右表分為6組特點：每2組只有一種共同物質(zhì),單一營養(yǎng)物質(zhì)要求的鑒定：,1,3,5,2,4,6,（3）營養(yǎng)缺陷型的用途生產(chǎn)菌(氨基酸、核苷酸、維生素等高產(chǎn)菌需求)；研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化等遺傳規(guī)律的遺傳標(biāo)記。,1.從生產(chǎn)中選育2.定向培育優(yōu)良品種一般指用特定因素長期處理微生物群體，同時不斷地對它們進(jìn)行移種傳代，以達(dá)到積累并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變株的目的。例：卡介苗（牛型結(jié)核分枝桿菌的減毒活菌苗）,三、自發(fā)突變與育種,思考題,1、誘變劑主要有哪三類？2、簡述紫外線照射誘變育種的原理、方法和基本步驟。3、化學(xué)誘變劑主要有哪些種類？4、烷化劑的作用機(jī)制是什么？5、簡述亞硝基胍誘變育種的原理、過程和安全注意事項。6、生物誘變劑按照誘變方式主要分為哪三類?為什么在篩選突變株時,不能直接用代謝產(chǎn)物,而必須用其結(jié)構(gòu)類似物?,一、電離輻射致DNA的損傷,電離輻射損傷DNA途徑:直接作用指射線直接作用于DNA分子，通過電離和激發(fā)使DNA受到損傷。間接作用指射線與DNA周圍其它原子或分子特別是水分子作用，產(chǎn)生具有很高活性的自由基（如OH，H和eaq-）進(jìn)而損傷DNA。,DNA鏈斷裂單鏈斷裂（SSB）雙鏈斷裂（DSB）DNA交聯(lián)DNA鏈交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)DNA二級和三級結(jié)構(gòu)的變化其中DSB是輻射所致生物學(xué)效應(yīng)中最重要的原初損傷，而非重接性的DSB則被認(rèn)為是細(xì)胞殺傷效應(yīng)的最重要的損傷。,二、電離輻射致DNA分子的變化,（一）DNA鏈斷裂單鏈斷裂：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈斷裂雙鏈斷裂：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中兩條互補(bǔ)鏈于同一對應(yīng)處或相鄰處同時斷裂,單鏈斷裂,雙鏈斷裂,1、DNA鏈斷裂的分子機(jī)制,（1）脫氧戊糖和磷酸二酯鍵的破壞（直接）（2）堿基損傷,2、不同條件下輻射所致的DNA鏈斷裂,1）充氧溶液中DNA雙鏈上引起SSB的概率均等，產(chǎn)生與放置時間、