第二節(jié)基因工程的原理和技術(shù)(正式)

.,第二節(jié)基因工程的原理和技術(shù),.,.,.,重組質(zhì)?；蛑亟MDNA,.,傳統(tǒng)的生產(chǎn)胰島素的方法只能從豬和羊的胰腺中提取,獲得1g胰島素大約需要100Kg的豬胰臟,糖尿病治療,1978年,科學(xué)家在大腸桿菌中成功表達(dá)了人胰島素,并于1982年被美國批準(zhǔn)上市,基因工程的基本原理,讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定和高效表達(dá)。,.,.,基因工程的基本操作程序,1、獲得目的基因,2、形成重組DNA分子,3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞,4、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞,5、目的基因的表達(dá),.,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因操作的基本步驟,一、提取目的基因?qū)⑿枰幕驈墓w生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來。,.,目的基因的序列未知1、從基因文庫中獲取目的基因的序列已知2、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成,獲取目的基因的常用方法：,.,1、基因文庫的構(gòu)建直接分離法（或鳥槍法）,該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。,.,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。,PCR擴(kuò)增儀,.,氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。,引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。,在酶的作用下，不斷延伸，合成雙鏈DNA。,多次循環(huán)，獲得大量雙鏈DNA分子。,PCR技術(shù)擴(kuò)增,.,人工合成法,逆轉(zhuǎn)錄法,根據(jù)已知氨基酸序列直接合成DNA,.,二、形成重組DNA分子,核心,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,兩個(gè)切口獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種,一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端,.,目的基因與質(zhì)粒的連接,.,三、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞,（1）常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,探究：轉(zhuǎn)基因過程中，怎樣選擇受體細(xì)胞？,轉(zhuǎn)基因植物,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,轉(zhuǎn)基因微生物,植物體細(xì)胞或受精卵,受精卵,大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌等,.,探究：為什么常用微生物作為受體細(xì)胞？,目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。微生物可通過發(fā)酵大量繁殖。,.,（2）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,受體細(xì)胞：細(xì)菌,氯化鈣,細(xì)胞壁的通透性增大,重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞,目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制,.,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,.,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,.,.,將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,顯微注射技術(shù),提純基因表達(dá)載體,.,1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,顯微注射技術(shù)（最多、最有效）,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,Ca2+處理，以增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。,.,探究：如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來？,1）原理：2）方法：3）舉例,所有受體細(xì)胞,四、篩選有目的基因的受體細(xì)胞,質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因,利用選擇培養(yǎng)基篩選,.,篩選含有目的基因的受體細(xì)胞,前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測(cè)出來。,細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。,.,多細(xì)胞生物的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。,.,受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因一定能完成表達(dá)嗎？,含有目的基因的受體細(xì)胞不一定都能表達(dá)。,(五)目的基因的表達(dá),看到目的性狀或分離到目的基因表達(dá)產(chǎn)物,外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的理論基礎(chǔ),基因是控制生物性狀的基本單位生物界共用一套遺傳密碼遺傳信息的傳遞都遵循中心法則的信息流動(dòng)方向,.,人胰島素原基因在大腸桿菌中只能表達(dá)和人胰島素原，要經(jīng)進(jìn)一步的加工后才能獲得具生物活性的胰島素。,.,甲生物,乙生物,新類型,基因敲除技術(shù),轉(zhuǎn)基因技術(shù),生物,新類型,.,能力提升：人的糖蛋白必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進(jìn)一步加工合成，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以使人的糖蛋白基因得以表達(dá)的受體細(xì)胞是（）A大腸桿菌B酵母菌CT4噬菌體D質(zhì)粒DNA,B,.,知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,.,基因探針（DNA探針）與目的基因雜交，有無雜交帶,.,基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取,形成重組DNA分子；,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,篩選含有目的基因的受體細(xì)胞和目的基因表達(dá),1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、顯微注射法、Ca2+處理法,DNA分子雜交技術(shù)、抗原抗體雜交技術(shù),分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定,四、本節(jié)小結(jié)：,.,例如：,將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。,.,1、用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是A常用相同的限制性內(nèi)切酶處理的基因和質(zhì)粒BDNA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶C可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒D導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達(dá),B,鞏固練習(xí),.,2下列屬于獲取目的基因的方法的是()利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取從受體細(xì)胞中提取利用PCR技術(shù)利用DNA轉(zhuǎn)錄人工合成ABCD,D,.,3基因工程又叫基因拼接技術(shù)。(1)在該技術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的為模板，成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成。(2)基因工程中常用的受體細(xì)胞有細(xì)菌、真菌、。(3)假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為運(yùn)載體，并以同一種限制性內(nèi)切酶切割運(yùn)載體與目的基因，將切割后的運(yùn)載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有種環(huán)狀DNA分子，它們分別是。,信使RNA,逆轉(zhuǎn)錄,雙鏈DNA(目的基因),動(dòng)植物細(xì)胞,3,運(yùn)載體自連的、目的基因片段自連的、運(yùn)載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子,.,4如何利用目的基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗寒能力提高的香蕉植株？在運(yùn)用轉(zhuǎn)基因香蕉的過程中，在生態(tài)安全方面可能會(huì)出現(xiàn)什么問題？（列舉兩點(diǎn)）,將目的基因插人土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，構(gòu)建表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化導(dǎo)人香蕉受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化的香蕉細(xì)胞通過組織培養(yǎng)形成植株。生態(tài)安全問題包括：外源基因擴(kuò)散到其他物種（外源基因漂移）；轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)散影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能；轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)散對(duì)生物多樣性的影響；轉(zhuǎn)基因植物殘?bào)w或分泌物對(duì)環(huán)境的影響。,.,(四)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞,(五)目的基因的表達(dá),四、基因工程的基本操作步驟,.,步驟一獲得目的基因,人工合成,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,已知序列：,從基因文庫獲得,未知序列：,(DNAlibrary),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction),化學(xué)合成,.,鳥槍法,從基因文庫獲得,.,PCR技術(shù),原理：前提：條件方式,DNA復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,模板DNA、兩個(gè)DNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）,.,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DN