流感的相關(guān)知識(shí)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 嚴(yán)選課件

流感的相關(guān)知識(shí)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),陳憲楷,2018.5.24,1,參考材料,C,流感病毒,2,參考材料,3,參考材料,流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。人類(lèi)的流行性感冒病毒(influenza,簡(jiǎn)稱(chēng)流感），屬正粘液病毒科，分A（甲）、B（乙）、C（丙）三型，呈球形或絲狀，是一種造成人類(lèi)及動(dòng)物患流行性感冒的負(fù)鏈RNA病毒。,4,參考材料,流感病毒的基因組,RNA與NP構(gòu)成RNP,基因組由8個(gè)短的單鏈RNA構(gòu)成，包含11個(gè)基因，編碼11個(gè)蛋白：血凝素(HA),神經(jīng)氨酸酶(NA),核蛋白(NP),M1,M2，NS1,NS2（NEP：核輸出蛋白），PA,PB1（聚合酶基團(tuán)1),PB1-F2和PB2。,5,參考材料,NP（核蛋白）和MP基質(zhì)蛋白(M1)抗原性穩(wěn)定，具有型特異性，將流感分A（甲）、B（乙）、c（丙）三型,6,參考材料,甲乙型流感主要亞型,血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原結(jié)構(gòu)極易發(fā)生變異，有亞型的特異性，是甲型流感病毒分亞型的主要依據(jù),甲型流感命名通常會(huì)遵照HN的規(guī)則命名，H代表血凝素，可分為16個(gè)亞型；N代表神經(jīng)氨酸酶，有9個(gè)亞型。會(huì)季節(jié)性在人群中出現(xiàn)的亞型通常為H1，2和3，以及N1和2,根據(jù)乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征主要分為B型(Yamagata)和B型(Victoria).,7,參考材料,根據(jù)國(guó)家流感中心報(bào)道，今年監(jiān)測(cè)到的流感病毒以甲型H1N1亞型和乙型（Yamagata）系為主，并且總體上甲型H1N1亞型的比例超過(guò)B（Yamagata）系。甲型H3N2亞型和B（Victoria）系以低水平共同流行。,我國(guó)流感流行現(xiàn)狀及亞型,不僅在中國(guó)，在歐洲一些國(guó)家和地區(qū)，今冬流行的流感病毒優(yōu)勢(shì)毒株是B型（Yamagata），這一毒株沉寂已久，普通人群對(duì)它的免疫基本缺失,8,參考材料,圖.中國(guó)流感病毒檢出率及其亞型分布,9,參考材料,流感的季節(jié)性流行,長(zhǎng)江以南,長(zhǎng)江以北,流感病毒在我國(guó)的活動(dòng)規(guī)律南北存在明顯的差異。,高峰期,10,參考材料,1.流感患者2.隱性感染者,1.近距離飛沫傳播2.接觸傳播,流感的流行病學(xué),傳染源,傳播途徑,病毒變異快,65歲以上老年人、嬰幼兒、慢性病患者,反復(fù)感染,并發(fā)癥,11,參考材料,感染流感的一般臨床表現(xiàn)：,流感一般急性起病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱(可達(dá)39-40)，伴畏寒、寒戰(zhàn)、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、極度乏力、食欲減退等全身癥狀，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流涕，也可有嘔吐、腹瀉等癥狀。,一般來(lái)講，流感全身癥狀比普通感冒重。流感為自限性疾病，發(fā)病3-4天后體溫逐漸消退，全身癥狀好轉(zhuǎn)。重癥病例可導(dǎo)致慢性基礎(chǔ)病加重，也可出現(xiàn)病毒性肺炎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等并發(fā)癥。,12,參考材料,13,參考材料,流感病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),采集標(biāo)本類(lèi)型：常規(guī)特殊咽拭子鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻洗液、含漱液血清呼吸道灌洗液,實(shí)驗(yàn)前處理,流感標(biāo)本采集采集時(shí)間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集，最好是24h內(nèi),14,參考材料,咽拭子采集,咽拭子用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將棉簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。注意：采樣前1h內(nèi)不要進(jìn)食和飲水，采樣液中嚴(yán)禁加入抗生素,15,參考材料,標(biāo)本的處理和保存,標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妫Ｓ玫牟蓸右河校篜H7.4-7.6的Hanks液或MEM,標(biāo)本應(yīng)在4保存24小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室對(duì)收到的標(biāo)本最好2448小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)或接種。,如不能在48h內(nèi)檢測(cè)或接種，標(biāo)本應(yīng)置于-70保存,16,參考材料,實(shí)驗(yàn)室生物安全要求,季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。,用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)時(shí)可以在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,流感病毒分離鑒定及其它檢測(cè)過(guò)程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過(guò)程必須在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里操作。,17,參考材料,常見(jiàn)的流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,18,參考材料,19,參考材料,季節(jié)性流感檢測(cè)流程,臨床標(biāo)本采集,接種MDCK細(xì)胞,接種雞胚,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，鑒定病毒,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性,PCR鑒定,20,參考材料,21,參考材料,流感病毒亞型的鑒定,22,參考材料,流感病毒亞型的鑒定流程,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),4個(gè)凝集單位配制“回滴”,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn),判定流感病毒型別,23,參考材料,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）,MDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA），確定病毒滴度,原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能結(jié)合并識(shí)別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識(shí)別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn),24,參考材料,25,參考材料,A,H,B,C,D,E,F,G,100ul病毒液,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,稀釋完病毒液后加入50ul紅細(xì)胞懸液,50ulPBS,稀釋病毒加入配制好的紅細(xì)胞懸液充分混勻，置室溫孵育30-60分鐘觀察記錄結(jié)果,操作簡(jiǎn)圖,26,參考材料,病毒原液,1:2,1:128,HA:32,HA128,HA:4,27,參考材料,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）結(jié)果判讀,HA滴度8，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)；,若傳12代后，HA滴度仍8者，可應(yīng)用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定,HA滴度60歲、體溫在38.038.9之間，流感病毒陽(yáng)性檢出率高于其他組；,參考文獻(xiàn)李珺，劉亞楠，田國(guó)保等.臨床實(shí)驗(yàn)室流感病毒檢測(cè)的相關(guān)影響因素分析J.國(guó)際病毒學(xué)雜志,2017，24（5）：331-335ISTIC張杰，武晶晶等.不同溫度和不同放置時(shí)間對(duì)總RNA提取濃度和純