《核酸的結(jié)構(gòu)》PPT課件.ppt

1、核酸生物化學(xué),南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 趙立青,核酸（DNA、RNA）是遺傳信息的載體生命活動(dòng)中居核心地位 基因工程引領(lǐng)現(xiàn)代生物技術(shù)基于核酸研究成就 基因組測(cè)序、功能基因組研究現(xiàn)代生命科學(xué)所有分支,第一章 核酸的結(jié)構(gòu),一、概述,1. 核酸結(jié)構(gòu)研究的作用 1865，Gregor Mendel 創(chuàng)立遺傳學(xué)基因 1911，Thomas H.Morgan（美）染色體遺傳理論：基因在染色體上呈線狀排列（ The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1933） 作用生物進(jìn)化 ；農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥 問(wèn)題基因組成？基因控制功能？基因復(fù)制？,Mendel,M

2、organ,基因的物理性質(zhì)？,1918，MDelbrck （徳）“論基因突變和基因結(jié)構(gòu)的性質(zhì)”，噬菌體團(tuán)隊(duì)，基因復(fù)制親代噬菌體顆粒如何在半小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生上百個(gè)子代顆粒（ The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969） 1944，Erwin Schrodinger （奧）生命是什么？活細(xì)胞的物理面貌：基因是遺傳信息攜帶者；由連續(xù)的幾種符號(hào)重復(fù)組成,Delbrck,Schrodinger,基因的化學(xué)本質(zhì)？,1868，F(xiàn)riedrich Miescher（瑞）從膿細(xì)胞核中分離出了一 種含磷酸的有機(jī)物，核素（nuclein）核酸（nucleic acid）

3、1877，Albrecht Kossel（徳）細(xì)胞核中的非蛋白組分核酸，分離出各種嘌呤、嘧啶，核糖（ The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1910 ）,Miescher,Kossel,DNA是遺傳物質(zhì),1944，Oswald Avery（美）細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1952，Alfred Hershey （美） 單股rRNA鏈可自行折疊，形成螺旋區(qū)和環(huán)區(qū)，所有螺旋區(qū)的堿基都是保守的; 所有來(lái)源rRNA均能形成4個(gè)結(jié)構(gòu)域（、和），結(jié)構(gòu)域均含許多莖、環(huán)，它們通過(guò)無(wú)距離堿基對(duì)的相互反應(yīng)彼此靠近; 絕大多數(shù)的rRNA堿基的特異功能尚不清楚。不配對(duì)堿基（環(huán)區(qū)或單股區(qū)

4、）可能涉及rRNA與其它RNA的結(jié)合（16S的3端與mRNA SD順序形成堿基配對(duì)。,E.Coli 16S rRNA,古細(xì)菌,4. mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),2006年耶魯大學(xué)研究組發(fā)現(xiàn)一個(gè)大的、高度保守的RNA motif，這種RNA motif通常存在于極端革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的一種多基因mRNA的一個(gè)非編碼部分。,重組基因mRNA翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu),四、 DNA的變性,1.變性的基本概念 DNA分子量不變、氫鍵破壞、雙螺旋部分解體；雙螺旋分離成兩條DNA單鏈，分子量2分化。 溫度、pH、離子強(qiáng)度、有機(jī)試劑等均能導(dǎo)致DNA變性。 變性DNA粘度降低、沉降系數(shù)增加、浮力密度增加、增色效應(yīng)、旋光度降低、細(xì)

5、菌轉(zhuǎn)化活性下降。,沉降系數(shù)：（sedimentation coefficient） 用離心法時(shí)，大分子沉降速度的量度，等于每單位離心場(chǎng)的速度?；騭=v/2r。s是沉降系數(shù)，是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。沉降系數(shù)以每單位重力的沉降時(shí)間表示，并且通常為120010-13秒范圍，10-13這個(gè)因子叫做沉降單位S，即1S=10-13秒，如血紅蛋白的沉降系數(shù)約為410-13秒或4S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間。,DNA的紫外吸收光譜,變性引起紫外吸收值的改變,增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液A260增高的現(xiàn)象。,核

6、酸的紫外吸收,由于核酸中堿基的共軛雙鍵，所以對(duì)紫外光有強(qiáng)烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用這一特性可進(jìn)行核酸的定量測(cè)定及純度分析。,紫外吸收法中DNA或RNA的定量,A260=1.0相當(dāng)于: 50g/ml雙鏈DNA 40g/ml單鏈DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 A260/A280 DNA純品: A260/A280 = 1.8 RNA純品: A260/A280 = 2.0,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂及堿基堆積力的破壞,DNA的降解,在溫度、pH急劇變化，或在酶、超聲波、高速攪拌、電離輻射的作用下，DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時(shí)維系DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵也被切斷，DNA分子

7、量發(fā)生變化的過(guò)程。,理化性質(zhì): 紫外吸收 粘度,退火,（annealing）,生物活性得到部分恢復(fù),2.變性DNA在一定條件下可以復(fù)性,淬火,DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué),DNA 復(fù)性過(guò)程基本上符合二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，其中第一步為慢反應(yīng)，因?yàn)閮蓷l鏈必須依靠隨機(jī)碰撞找到一段堿基配對(duì)的部分，首先形成雙螺旋。第二步為快反應(yīng)，尚未配對(duì)的其他部分堿基配對(duì)相結(jié)合，象拉鎖鏈一樣迅速形成雙螺旋。,復(fù)性反應(yīng)：,S：single strand DNA D：double strand DNA,完全變性DNA的復(fù)性反應(yīng)可表示為：,經(jīng)重排，積分得：,c0：t=0時(shí)，起始DNA的濃度（mol/L） c：t時(shí)間時(shí)，單鏈DNA的濃度（mol

8、/L） k：復(fù)性反應(yīng)常數(shù)（L/molsec） t：復(fù)性時(shí)間（sec）,DNA復(fù)性反應(yīng)的初始濃度co 與反應(yīng)完成一半所需時(shí)間的乘積為常數(shù)。在一定條件下，復(fù)性反應(yīng)的速度可以用cot1/2 來(lái)衡量。 實(shí)驗(yàn)證明K值與復(fù)性DNA分子量成正比。cot1/2 或K稱(chēng)DNA分子復(fù)雜度(complexity)，DNA片段越大復(fù)性越慢。 DNA的濃度越大復(fù)性越快。,3.溫度對(duì)DNA變性的影響,任何有機(jī)固體物質(zhì)都有一個(gè)特定的熔點(diǎn) DNA分子內(nèi)部也是一個(gè)十分規(guī)則有序的結(jié)構(gòu)有特定熔點(diǎn)（Tm）。 與有機(jī)固體熔解過(guò)程相似，在緩慢將DNA溶液加熱過(guò)程中，開(kāi)始并不出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，直到某一狹窄溫度范圍，發(fā)生螺旋到線團(tuán)轉(zhuǎn)變。DN

9、A熔解。,DNA的熔解溫度（melting temprature Tm）,DNA在加熱變性時(shí)，紫外吸收增加值達(dá)總增加值一半時(shí)（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)？）的溫度稱(chēng)為該DNA的變性溫度，也稱(chēng)熔點(diǎn)或熔解溫度，用Tm 表示。DNA的Tm值一般在 8295 度之間，每種DNA都有一個(gè)特征性的Tm值。,解鏈曲線,如果在連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度對(duì)A260值作圖，所得的曲線稱(chēng)為解鏈曲線。,影響Tm值的因素,DNA的均一性：均質(zhì)DNA Tm值范圍較窄，異質(zhì)DNA Tm值的范圍較寬 DNA中G-C對(duì)的含量 經(jīng)驗(yàn)式: (G+C)%=(Tm-69.3)2.44 鹽離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度低的介質(zhì)中，Tm 值較低范圍較寬；

10、離子強(qiáng)度較高的介質(zhì)中，Tm 值較高，范圍較窄。（DNA在含鹽緩沖液中保存）,G-C含量對(duì)Tm值的影響,肺炎球菌,粘質(zhì)沙雷菌,鹽濃度對(duì)Tm值的影響,4. pH對(duì)DNA變性的影響,介質(zhì)中pH的改變可導(dǎo)致DNA變性 25，0.05mol/L NaCl溶液中，從中性到pH4.5左右，約發(fā)生10%的DNA可逆變性。 pH3以下、pH12以上為不可逆變性。 通常介質(zhì)中pH在5.5-8.5范圍內(nèi)，DNA Tm值變化不大。,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH2 NH2+ (質(zhì)子化),改變氫鍵的形成與結(jié)合力,極端pH條件的影響,一切減弱氫鍵、堿基堆積力的因素 均將使Tm 值降低,堿基因pH不同采取同分

11、異構(gòu)形式,DNA雙鏈中堿基間在氨基氫和羰基氧之間形成氫鍵,5. 堿基組成對(duì)DNA變性的影響,中性pH條件下，GC對(duì)增加，DNA熱穩(wěn)定性增加。 0.15mol/L NaCl和0.015mol/L檸檬酸鈉溶液中，G+C含量每增加0.01mol/L，DNA Tm值增加0.41。 DNA熱穩(wěn)定性還與堿基的排布有關(guān)，多個(gè)G或C 連續(xù)排列抗熱核心。,增色效應(yīng)的跳躍現(xiàn)象 ( Jump of Hyperchromicity ),高分子量的DNA分子在熱變性過(guò)程中, 富含AT區(qū)域首先發(fā)生 變性, 然后逐步擴(kuò)展, 表現(xiàn)增色效應(yīng)的跳躍現(xiàn)象。變性加快。,6. 離子強(qiáng)度對(duì)DNA變性的影響,單鏈DNA主鏈的磷酸基團(tuán),負(fù)電荷的靜電斥力,兩條單鏈DNA的分離,Na+在磷酸基團(tuán)周?chē)纬傻碾娮釉?對(duì)靜電斥力產(chǎn)生屏蔽作用,減弱靜電斥力,7. 有機(jī)溶劑對(duì)DNA變性的影響,許多有機(jī)溶劑可導(dǎo)致DNA變性 酰胺、脲、氨基甲酸酯、醇類(lèi)等促使DNA變性，與DNA中GC含量、介質(zhì)離子強(qiáng)度、變性劑濃度、DNA濃度有關(guān)。,有機(jī)溶劑變性機(jī)制,有機(jī)溶劑存在，離子溶劑化能力低，難于中和DNA分子負(fù)電荷； 有機(jī)溶劑具疏水性，穩(wěn)定因變性暴露的疏水基團(tuán)； 尿素，酰胺與堿基間形成氫鍵改變堿基對(duì)間的氫鍵，Tm 值可降至40