8.PCT主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1、廣州鴻琪光學(xué)儀器科技有限公司.廣州鴻琪光學(xué)儀器科技有限公司降鈣素原（PCT）檢測試劑盒（膠體金法）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料膠體金免疫檢測技術(shù)是目前臨床快速檢測的常用方法之一。廣州鴻琪光學(xué)科技有限公司結(jié)合國內(nèi)外對降鈣素原檢測試劑盒在臨床診斷中的應(yīng)用情況開發(fā)了降鈣素原（PCT）定量檢測試劑盒（膠體金法），結(jié)合鴻琪公司開發(fā)的免疫膠體金讀數(shù)儀對血清、血漿和全血標(biāo)本中的降鈣素原（PCT）進(jìn)行定量檢測。一、 反應(yīng)原理描述人降鈣素原（PCT）檢測試劑（膠體金法）是一種不需要任何儀器設(shè)備的全血/血清/血漿檢測法，采用膠體金免疫層析技術(shù)，試劑盒含有被預(yù)先包被在玻璃纖維上的膠體金標(biāo)記的抗PCT單克隆抗體(

2、mAb1)以及固定于膜上測試區(qū)（T）的抗PCT單克隆抗體(mAb2)和質(zhì)控區(qū)（C）的相應(yīng)抗體。測試時，將標(biāo)本滴入試劑盒加樣孔（S）內(nèi), 標(biāo)本中如含有人降鈣素原（PCT），則標(biāo)本中的人降鈣素原（PCT）分別與預(yù)先包被在玻璃纖維上的抗PCT單克隆抗體(mAb1)結(jié)合，結(jié)合物在毛細(xì)效應(yīng)下向上層析，隨后會被固定在膜上相應(yīng)測試區(qū)的抗PCT單克隆抗體(mAb2)結(jié)合捕獲，從而在相應(yīng)測試區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶。如是陰性標(biāo)本，則相應(yīng)測試區(qū)內(nèi)將沒有紫紅色條帶出現(xiàn)。無論標(biāo)本中是否存在人降鈣素原（PCT），一條紫紅色條帶都會出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)（C）內(nèi)。質(zhì)控區(qū)（C）內(nèi)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠標(biāo)本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)

3、，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。通過金標(biāo)免疫分析儀檢測測試區(qū)（T）顯色深度，再經(jīng)過保存在卡殼上二維碼上的定標(biāo)曲線計算得到檢測結(jié)果。膠體金標(biāo)記的基本原理是膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金標(biāo)記所用的主要原輔料有：抗PCT單克隆抗體(mAb1)、氯金酸、檸檬酸三鈉，玻璃纖維。NC膜包被的基本原理是蛋白首先通過靜電作用和硝酸素纖維膜結(jié)合，然后靠H鍵和疏水作用維持長時間結(jié)合。NC膜包被所用的主要原輔料有：硝酸素纖維膜、抗PCT單克隆抗體(mAb2)和羊抗鼠IgG。二、主要生產(chǎn)工藝的各主要工序流程圖藍(lán)色工序在10萬

4、級潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，其他工序在普通生產(chǎn)區(qū)。領(lǐng) 料配包被用液體配標(biāo)記用液體配包被溶液標(biāo)記包 膜稀釋金標(biāo)交聯(lián)溶液噴 金晾 干 干 燥No不合格品控制不合格品控制半成品檢驗半成品檢驗NOYesYes入 庫入 庫組 裝NO o放 行成品檢驗不合格品控制總 裝定 標(biāo)Yes三、主要工序所用主要原輔料、具體步驟即每一步驟的具體實現(xiàn)方法該產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝包括各種工作溶液的配置，膠體金標(biāo)記物、包被抗原或抗體等濃度確定，膠體金標(biāo)記物制備，檢測線及質(zhì)控線的制備等步驟，并通過產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（一）各種工作溶液的配置1 配標(biāo)記用液體：膠體金制備：0.01%氯金酸（HAuCl

5、4），水溶液100ml加熱至沸騰，加入1%檸檬酸三鈉1ml，混勻，煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由藍(lán)經(jīng)紫變紅后，冷卻即可。2 配金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液包被緩沖液為10mM Tris-HCl，1.0%BSA, 0.01% NaN3，2%蔗糖。3 配包被用液體包被緩沖液為10mM Tris-HCl，2%蔗糖。4 配包被溶液對照線包被羊抗鼠IgG,包被濃度1.0mg/ml檢測線分別包被抗PCT單克隆抗體(mAb2)，包被濃度均為1.0mg/ml噴量1.0l/cm，電機(jī)速度511HZ，。（二）膠體金標(biāo)記物、包被抗原或抗體等濃度確定1、膠體金標(biāo)記物：分別以20ug/ml最終濃度將抗PCT單克隆抗體(mAb1)

6、加入膠體金溶液中進(jìn)行標(biāo)記。2、檢測線包被抗原濃度：用包被緩沖液稀釋抗PCT單克隆抗體(mAb2)，終濃度均為1.0mg/ml。3、對照線包被濃度：用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG，終濃度為1.0mg/ml。（三）膠體金標(biāo)記物的制備采用枸櫞酸三鈉還原法制備膠體金，選擇30nm膠體金顆粒用于標(biāo)記，分別以20mg/ml最終濃度抗PCT單克隆抗體(mAb1)加入膠體金溶液中?？焖贁嚢?分鐘，再慢速攪拌15分鐘。分別加入20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘（4000轉(zhuǎn)），吸去上清，沉淀以金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液（原膠體金溶液體積的1/10）重新懸浮。置2-8保存，在規(guī)定的保存期內(nèi)使用。以金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液對金標(biāo)抗

7、PCT單克隆抗體(mAb1)進(jìn)行按一定比例稀釋， 然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上，噴量1.0l/cm，噴筆口徑為10mm，將噴好的玻璃纖維放置烘房中，372，干燥24小時。（四）檢測線及質(zhì)控線的制備 取抗PCT單克隆抗體(mAb2)終濃度分別為1.0mg/ml，噴量1.0l/cm，電機(jī)速度511在硝酸纖維素膜上制備檢測線，室溫干燥；取已確定使用的用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG，終濃度為1.0mg/ml，用同樣方法制備控制線。檢測線與控制線在NC膜上之間的距離約3.5+0.5mm，線的寬度約0.8-1.0mm；前后均勻；并置溫度1526；溫度30%；干燥24小時以上。（五）半成品檢驗按批號抽取一定數(shù)

8、量的半成品檢測，對所抽樣的半成品做準(zhǔn)確性、最低檢出量、線性、精密性、穩(wěn)定性等性能方面的檢測，應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（六）貼板、切條、裝卡 在溫度1530；濕度25%條件下，將標(biāo)記好的玻璃纖維、硝酸纖維膜、聚紙板、吸水紙、樣品墊（經(jīng)特殊處理，可過濾紅細(xì)胞）等物組裝，要求材料附著牢固，膜條切割應(yīng)寬為4.01.0mm，然后裝塑料殼。（七）定標(biāo)利用公司內(nèi)部校準(zhǔn)品對試劑進(jìn)行定標(biāo)，定標(biāo)曲線保存到二維碼中。(八)組裝1）把二維碼貼到試劑卡殼上，并將干燥劑、吸管等裝入鋁箔袋，封口。2）裝盒。（九）成品檢驗成品做準(zhǔn)確性、最低檢出量、線性、精密性、穩(wěn)定性等性能方面的檢測，應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。四、主要工藝的確定1 檢測線包被

9、濃度試驗設(shè)計：固定加液量（噴量1.0l/cm，電機(jī)速度511HZ），用包被緩沖液調(diào)整抗PCT單克隆抗體(mAb2)的包被濃度分別為0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ ml、2.0 mg/ ml，分別進(jìn)行包被，晾干后按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次，。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標(biāo)準(zhǔn)差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均值為M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。試驗結(jié)果：包被濃度M0+2SDM10.3mg/ml0.

10、5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/ml2.5mg/ml結(jié)論：當(dāng)包被濃度分別達(dá)到1.0mg/ml， 最低檢測限0.1ng/ml，而進(jìn)一步提高包被濃度，這個項目的靈敏度沒有明顯的改變。最終確定這個項目檢測線包被濃度均為1.0 mg/ml。2 對照線包被濃度試驗設(shè)計：固定加液量（噴量1.0l/cm，電機(jī)速度511HZ），用包被緩沖液調(diào)整羊抗鼠IgG抗體濃度為0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.4 mg/ml、1.8mg/ml，分別進(jìn)行包被，晾干后按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，以陰性標(biāo)本加樣比較不同包被濃度對照線顯色時間。試驗結(jié)果：羊抗鼠IgG對照線顯色時間0.5mg/m

11、l超過4 min0.8mg/ml超過4 min1.0mg/ml2min1.5mg/ml2min2.0mg/ml2min結(jié)論：包被濃度達(dá)到1.0mg/ml,，對照線即在2 min內(nèi)清晰可辯，符合設(shè)計要求。最終確定對照線包被濃度1.0mg/ml。3 膠體金標(biāo)記抗PCT單克隆抗體(mAb1)的制備3.1膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定試驗設(shè)計：將膠體金分裝15管，每管1ml，每個項目5管。將抗PCT單克隆抗體(mAb1)分別以5g/ml、10g/ml、20g/ml、30g/ml、40g/ml濃度加入上列膠體金溶液中，快速攪拌1分鐘，再慢速攪拌15分鐘。加20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘（10000

12、轉(zhuǎn)），吸去上清，沉淀以金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液重新懸浮。以金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液對金標(biāo)抗PCT單克隆抗體(mAb1)進(jìn)行按一定比例稀釋， 然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上，噴量1.0l/cm，噴筆口徑為10mm，將噴好的玻璃纖維放置烘房中，372，干燥24小時。按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條。分別進(jìn)行包被，晾干后按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標(biāo)準(zhǔn)差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。

13、比較不同標(biāo)記蛋白用量的靈敏度高低。包被濃度M0+2SDM10.3mg/ml0.5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/ml2.5mg/ml結(jié)論：當(dāng)標(biāo)記濃度分別達(dá)到20g/ml, 試劑盒能滿足最低檢出量參考品0.1ng/ml檢出要求，而進(jìn)一步提高包被濃度，這三個項目的檢測線顯色程度沒有明顯的改變。最終確定標(biāo)記濃度均為20g/ml。3.2金標(biāo)抗PCT單克隆抗體(mAb1)稀釋濃度的確定試驗設(shè)計：將抗PCT單克隆抗體(mAb1)用金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液按1：1、1：2、1：3比例進(jìn)行稀釋，稀釋好后按固定噴金參數(shù)，將金標(biāo)抗PCT單克隆抗體(mAb1)噴在 玻璃纖維上，干燥，按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，分別以

14、降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標(biāo)準(zhǔn)差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。比較不同標(biāo)記蛋白用量的靈敏度高低。稀釋濃度M0+2SDM11:11:21:3結(jié)論：只有當(dāng)稀釋度達(dá)到1：1時，最低檢測限0.1ng/ml，符合設(shè)計要求。最終確定金標(biāo)單抗稀釋度為1：1。4 設(shè)計定型通過以上實驗，我們確定采用的生產(chǎn)工藝為：（1） NC膜包被：檢測線：用包被緩沖液稀釋抗PCT單克隆抗體(mAb2)到終濃度為1.0m

15、g/ml。對照線：用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG，終濃度為1.0mg/ml。包膜參數(shù)：噴量1.0l/cm，電機(jī)速度511HZ。將包被好的NC膜放置烘房中，372，干燥24小時。（2）膠體金標(biāo)記：以20mg/ml最終濃度將抗PCT單克隆抗體(mAb1)加入膠體金中。快速攪拌1分鐘，再慢速攪拌15分鐘。加20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘（4000轉(zhuǎn)），吸去上清，沉淀以金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液重新懸浮。然后用金標(biāo)記物干燥基礎(chǔ)液分別按1：1進(jìn)行稀釋，然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上，噴量1.0l/cm，噴筆口徑為10mm，將噴好的玻璃纖維放置烘房中，372，干燥24小時。按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條。成品檢驗方案

16、：組裝成的試劑條是否在15分鐘內(nèi)檢出降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml。成品檢驗結(jié)果：組裝成的試劑條能在15分鐘內(nèi)檢出降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml。結(jié)論：該生產(chǎn)工藝生產(chǎn)出來的試劑條符合我們的產(chǎn)品要求，確認(rèn)為以后采用的生產(chǎn)工藝。五、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)部質(zhì)控品的確立1. 企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定的緣由由于目前人降鈣素原的檢測尚無一個統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)，我們參考已上市的人降鈣素原檢測試劑盒產(chǎn)品的性能指標(biāo)，設(shè)計了本品的企業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，制定了內(nèi)部校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。2.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)2.1 準(zhǔn)確性標(biāo)準(zhǔn)：取PCT零濃度參考品，作為基礎(chǔ)樣本，將其等體積分為4份，在任意3份中添加PCT純分析物，使加入濃度分別為5

17、ng/ml、15ng/ml、40ng/ml，制成3份回收樣本，分別計算其回收率，然后計算平均回收率，平均回收率應(yīng)95%。2.2 最低檢測限標(biāo)準(zhǔn)分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標(biāo)準(zhǔn)差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。最低檢測限必須0.1ng/ml。2.3線性標(biāo)準(zhǔn)用50ng/ml的高濃度參考品和0.1ng/ml的低濃度參考品，混合成8個稀釋濃度（Xi），每個濃度測定3次，分別求出檢測結(jié)果均值即

18、為實測值（Yi）。以稀釋濃度（Xi）為自變量，以檢測結(jié)果實測值（Yi）為因變量求出線性回歸方程。計算線性回歸的相關(guān)系數(shù)（r）及線性相對偏差，要求線性相關(guān)系數(shù)r0.975，線性相對偏差不超過15%。2.4精密性標(biāo)準(zhǔn)批內(nèi)：用同一批次試劑盒分別對企業(yè)內(nèi)部1ng/ml和40ng/ml PCT參考品進(jìn)行檢測，各平行測定10次，批內(nèi)變異系數(shù)CV15%。批間：取三個不同批次的產(chǎn)品，分別測定企業(yè)內(nèi)部1ng/ml和40ng/ml PCT參考品，每個批號重復(fù)檢測10次，批間變異系數(shù)CV20%。3. 內(nèi)部質(zhì)控品的制備3.1 最低檢出量質(zhì)控品的制備和驗證3.1.1 降鈣素原零濃度質(zhì)控品的制備和驗證 制備方法：10份經(jīng)確認(rèn)PCT為陰性、無肉眼可見的溶血、黃疸、乳糜顆粒，HIV抗體、HBV抗原、HCV抗體檢測均為陰