醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告課件

1、微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告題目 膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測 成績年級專業(yè)實(shí)驗(yàn)者 學(xué)號組號 小組成員指導(dǎo)老師一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解細(xì)菌生長的基本營養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基的種類。2. 掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。3. 掌握無菌操作技術(shù)。4. 掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。5. 掌握油鏡的正確使用。6. 掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備以及革蘭氏染色法。7. 熟悉幾種常用的細(xì)菌生化反應(yīng)的名稱、原理、方法、結(jié)果分析及用途。8. 掌握血漿凝固酶試驗(yàn)的原理、方法及用途。9. 掌握紙片擴(kuò)散法檢測藥物敏感性原理及應(yīng)用。10. 掌握玻片凝集試驗(yàn)的原理方法、方法、結(jié)果觀察與判斷。二、 實(shí)驗(yàn)器材1藥品與試劑：營養(yǎng)瓊脂粉、營養(yǎng)肉湯粉、半固

2、體瓊脂粉、蒸餾水、膿汁標(biāo)本、糞便標(biāo)本、普通營養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、斜面培養(yǎng)基管、液體培養(yǎng)基管、半固體培養(yǎng)基管、結(jié)晶紫染液（第 1 液）、盧戈氏碘液（第 2 液）、95%酒精（第 3 液）、稀釋石炭酸復(fù)紅（第 4 液）、香柏油、二甲苯、葡萄糖發(fā)酵微量管、乳糖發(fā)酵微量管、兔血漿、生理鹽水、診斷血清、 Muller-Hinton 瓊脂平板、青霉素濾紙片、鏈霉素濾紙片、慶大霉素濾紙片2. 器材：1500W 電爐、天平、稱量紙、藥勺、三角燒瓶、量筒、試管、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮紙、硫酸紙、橡皮筋、試管筐、尺、平皿、酒精燈、電爐、接種環(huán)、接種針、染色架、吸水紙、擦鏡紙、打火機(jī)、筆、顯微鏡、小

3、砂輪、載玻片、鑷子、試管刷、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱三、 方法與步驟1、培養(yǎng)基的制備：培養(yǎng)基稱量干粉培養(yǎng)基(g)水量(ml) 煮沸( 次） 分裝(ml) 備注2 瓶，500ml營養(yǎng)瓊脂 11.4 300錐形瓶，平板 15支，中試營養(yǎng)瓊脂 2.9 75 3 5 管，斜面 15 支小試營養(yǎng)肉湯 1.1 50 1 1 管，液體 15支，小試半固體瓊脂 1.7 60 3 3 管，高層干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙、牛皮紙，用 橡皮筋扎好放入講臺邊的滅菌桶或滅菌筐內(nèi)送到髙壓蒸汽滅菌室滅菌（用于倒平板的培養(yǎng)基不用加熱溶解，搖勻即可）2、細(xì)菌的分離培養(yǎng)平板劃線分離法甲膿汁標(biāo)本營養(yǎng)瓊脂平

4、板 ( 黃色）乙膿汁標(biāo)本營養(yǎng)瓊脂平板 ( 黃色）丙一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板 ( 紫色）丁一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板 ( 紫色）方法：（1)右手拿接種環(huán)（如握筆式 ) ，燒灼滅菌，欲伸入試管內(nèi)的接種環(huán)桿部分亦要 迅速通過火焰 23 次，以殺滅其表面細(xì)菌； （2) 左手握住盛有標(biāo)本的試管的下端，右手以無名指、小指與手掌在火焰旁拔出試管棉塞并挾住之，將管口迅速通過火焰三次滅菌； （3)立 即將已滅冷卻的接種環(huán)伸入試管內(nèi)，沾取標(biāo)本（或菌液）一環(huán)，試管口火焰滅菌后塞好棉塞 ; (4) 左手斜持平板，略開蓋，在酒精燈火焰左前方約 56cm處，將接種環(huán)上的菌液涂抹于平板表面的邊緣部分； （5)燒灼接種環(huán)，冷卻

5、后，從原涂抹部分開始，連續(xù)平行劃線，每次只劃平板的 1/41/5 ，劃畢后接種環(huán)再經(jīng)火焰滅菌，冷卻后用同樣方法在平板其余部分劃線， 每次劃線要與前次劃線重疊 1-3條，共計(jì) 3次（區(qū)) ；（6) 接種完畢，將接種環(huán)燒灼滅菌后方可放下； （7) 將培養(yǎng)皿倒置， 37 C培養(yǎng) 34 小時(shí)后，觀察結(jié)果。3、細(xì)菌的純培養(yǎng)斜面接種分工甲普通平板黃色菌落 1 支斜面 乙普通平板白色菌落 1 支斜面丙EMB平板紫黑菌落 1 支斜面 丁 EMB平板粉紅菌落 1 支斜面方法：接種環(huán)套住菌落輕刮取菌接種環(huán)取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉 條細(xì)菌接種線再伸入底部，自下向上，作蜿蜒劃線細(xì)菌涂布接種在斜面培養(yǎng)基的表面

6、 斜面正面上 2/3 作標(biāo)記：組號、顏色收集平板 - 滅菌桶內(nèi)（ 平板底部朝下，蓋朝上放置 ）速送滅菌室高壓蒸汽滅菌洗刷。4、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查涂片干燥 固定 染色(1) 涂片干燥固定甲黃色，紫黑。 乙白色，粉紅。丙黃色，紫黑。丁白色，粉紅。方法：涂片：接種環(huán)取鹽水 3ulX2 滴，水滴間距小于 2cm;取菌苔少許（ 1mm小菌落半個(gè)）與鹽水混勻，涂成大于 lcm2; 涂畢環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。干燥固定：手持載玻片端，涂膜朝上，兩個(gè)涂膜快速通過火焰外層 3次，時(shí)間 2? 3 秒鐘。(2) 革蘭染色涂片干燥固定結(jié)晶紫初染 1分鐘水洗盧戈碘液媒染 1 分鐘水洗 95%乙

7、醇脫色約 20 秒鐘7 尺洗稀釋品紅復(fù)染 1 分鐘水洗吸干，鏡檢。油鏡使用方法： 10X 物鏡看清標(biāo)本滴加香柏油 100X 油鏡浸泡油 中模糊物象細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像記錄結(jié)果關(guān)閉電源擦鏡紙拭去香柏油 擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（ 7:3)混合液擦拭擦鏡紙擦拭油鏡。5、液體培養(yǎng)基接種（肉湯接種）甲黃色，乙白色，丙紫黑，丁粉紅。方法：（1)接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接種； （2)在管壁上， 將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌； （3) 標(biāo)記：組號，顏色6、細(xì)菌的生化試驗(yàn)等a. 細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)甲紫黑菌苔葡萄糖 乙紫黑菌苔乳糖丙粉紅菌苔葡萄糖 丁粉紅菌苔乳糖方法：用砂輪在糖發(fā)酵

8、管液面上方 2? 3cm處切割，然后，向切口外側(cè)分離掰斷，管 口燒灼滅菌。接種針斜面取菌，伸入培養(yǎng)基內(nèi)，在管壁上，上下研磨接種。退出接種針， 燒灼滅菌。管口朝向相同，放置在平皿內(nèi)。b. 抗菌素敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法甲黃色菌液 乙白色菌液丙紫黑菌液 丁粉紅菌液方法：先取環(huán)菌液；沿平板直徑拉一條細(xì)菌接種線；再取一環(huán)菌液；旋轉(zhuǎn) 平板 90 度角，拉另一條接種線，使兩條細(xì)菌接種線呈“十字形” ；然后在平板上半部，作 連續(xù)來回密集劃線，每次劃二分之一平板；旋轉(zhuǎn)平板 90 度角，二次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平 板 90 度角，三次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平板 90度角，四次密集劃線；設(shè)三點(diǎn)，呈等邊三角距離； 點(diǎn)距離平板邊緣約

9、15mm?; 作標(biāo)記：青、先、慶； ? 鑷子尖嘴朝下，夾取相應(yīng)藥物紙片 的邊緣，平貼在已設(shè)定的位置上，輕輕按壓紙片。c. 血漿凝固酶試驗(yàn)兔血漿+黃色，白色方法：取二滴兔血漿 (rabbit plasma) 置于潔凈的玻片上。分別用接種環(huán)取白色和黃 色菌苔( 約 2? 3 個(gè)菌落的菌量 ) 與血漿研磨混合成直徑 8? 10mm的一層薄菌膜，立即觀察結(jié)果。菌液出現(xiàn)明顯凝塊者為陽性，否則為陰性。d. 半固體穿刺接種法甲白色 乙金黃色丙紫黑 丁粉紅方法：接種針斜面取菌，從半固體中心，垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部 5 分之 4 處，再循原來的路線, 退出接種針；管口、接種針經(jīng)火焰燒灼滅菌；標(biāo)記 : 組號,

10、顏色。7、細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)、結(jié)果分析玻片凝集試驗(yàn)方法：（1)取潔凈的載玻片一張， 將磨面近端設(shè)為對照區(qū)， 滴加生理鹽水 15ul 。遠(yuǎn)端設(shè) 為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清 15ul; (2) 用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約 2 個(gè)小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻。四、結(jié)果與討論（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 洗手前后對比：圖 1.1 甲乙洗手前后圖 1.2 丙丁洗手前后空氣的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，暴露在手機(jī)下） ：圖 1.3 空氣的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果CFU/m3 50000N AT=50000 1 3 (3.14 3.5cm2) 40/m3=1118/m32. 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果：(1 ) 膿汁

11、標(biāo)本在普通平板上有黃色、白色兩種菌落，菌落的色素是脂溶性的，是細(xì)菌本身的顏色。菌落直徑 2mm左右、圓形、隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、不透明。(2 ) 糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落，菌落色素是水溶性的， 不是細(xì)菌本身的顏色， 紫黑色菌落具有金屬光澤、 大而隆起、 不透明的菌落，菌落直徑 2? 3mm；粉紅色菌落淡粉紅色，半透明，直徑 1? 2mm.（3）從四張平板畫線的結(jié)果上來看，四張均有不足，得不到特別典型的菌落。第一二張膿汁的營養(yǎng)瓊脂平板，前面兩區(qū)涂抹太密集，而板的其他部位未充分利用，得不到十分明顯的菌落。第三糞便的平板涂布時(shí)，用力過大劃破平板，而第四張糞便的平

12、板第一區(qū)太稀疏，未充分利用平板，故在培養(yǎng)后未見到數(shù)量較少的粉紅菌落，原因是初次劃線時(shí)，力度與劃線的密度均未能很好地掌握，動作不熟練，不能連續(xù)劃線。圖 2.1 甲，乙膿汁標(biāo)本營養(yǎng)瓊脂平板圖 2.2 丙，丁糞便標(biāo)本伊紅美藍(lán)平板3. 細(xì)菌的純培養(yǎng)：在斜面培養(yǎng)基上得到四種菌體的純培養(yǎng)標(biāo)本，從普通平板上挑取的金黃色 或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，金黃色或白色。從伊紅美藍(lán)平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、前者不透明，后者透明。圖 3.1 四種菌落在斜面培養(yǎng)基上生長情況右左向右依次為金黃，白色，紫黑，粉紅菌苔4. 細(xì)菌的

13、形態(tài)學(xué)檢查 :圖 4.1 膿汁菌苔（左邊為金黃色菌苔，右圖為白色菌苔）圖 4.2 糞便菌苔（左圖為紫黑色菌苔，右圖為粉紅菌苔）鏡下觀察：用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下均為 G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為 G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。5、液體培養(yǎng)基接種圖 5.1 液體培養(yǎng)基接種結(jié)果從左至

14、右分別為： （黃色細(xì)菌白色細(xì)菌紫黑色細(xì)菌粉紅色細(xì)菌 ）6. 細(xì)菌的生化試驗(yàn)等 :（1）半固體穿刺接種法圖 6.1 半固體穿刺結(jié)果觀察及討論：表 1. 動力試驗(yàn)結(jié)果菌苔 半固體實(shí)驗(yàn)紫黑細(xì)菌 1 +紫黑細(xì)菌 2 +粉紅細(xì)菌 1 -粉紅細(xì)菌 2 -+：陽性 - ：陰性1、紫黑細(xì)菌 1 和 2 細(xì)菌自接種部位向四周移動、擴(kuò)散生長，培養(yǎng)基略微呈毛刷狀或云霧狀混濁狀態(tài)，表明其有鞭毛。結(jié)合其他組的結(jié)果，我們認(rèn)為紫黑菌苔應(yīng)當(dāng)是動力陽性的。2、粉紅細(xì)菌菌苔均沿著直線生長，可看出其無鞭毛。(2) 細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)圖 6.2 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 . 從左至右分別為：（紫黑葡萄糖紫黑乳糖粉紅葡萄糖粉紅乳糖 ）編 菌苔

15、糖發(fā) 反應(yīng)現(xiàn)象 結(jié)果描述 符號 酵管 號甲 紫黑 糖發(fā)酵管變黃色有氣泡 分解 X糖產(chǎn)酸又產(chǎn)氣 乙 紫黑 糖發(fā)酵管變黃色有氣泡 分解 X糖產(chǎn)酸又產(chǎn)氣 丙 粉紅 糖發(fā)酵管變黃色無氣泡 分解 X糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 +丁 粉紅 糖發(fā)酵管仍紫色無氣泡 分解 X糖不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 -+：產(chǎn)酸或陽性 ：產(chǎn)酸產(chǎn)氣 - ：陰性紫黑細(xì)菌微型發(fā)酵關(guān)內(nèi)液體變黃，產(chǎn)生氣泡，氣泡的高度分別為 10mm和 17mm，說明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅細(xì)菌只分解葡萄糖，不產(chǎn)氣，不分解乳糖。(3) 抗菌素敏感試驗(yàn)結(jié)果 :圖 6.3 抗菌素敏感試驗(yàn)結(jié)果表 3 各菌抑菌圈直徑（ mm）表菌苔 青霉素 頭孢曲松 慶大霉素金黃

16、色 白色 紫黑 3027粉紅 3530表 4. 藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析青霉素 頭孢曲松 慶大霉素金黃色+ + +白色 +紫黑 - + +粉紅 - + +- ：耐藥 ：中度敏感 + ：敏感金黃細(xì)菌對青霉素敏感，對頭孢曲松敏感，對慶大毒素敏感白色細(xì)菌對青霉素中度敏感，對頭孢曲松中度敏感，對慶大毒素敏感紫黑細(xì)菌對青霉素耐藥，對頭孢曲松敏感，對慶大毒素敏感粉紅細(xì)菌對青霉素耐藥，對頭孢曲松敏感，對慶大毒素敏感（4）血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖 6.4 白色（左）與金黃色（右）菌苔1、白色菌苔不發(fā)生凝塊，容易涂抹。呈均勻乳白狀態(tài)。2、黃色菌苔能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白 ,附著于菌體表

17、面 , 形成凝塊，涂抹不開。說明黃色細(xì)菌為致病菌。7. 細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果：圖 6.5 粉紅菌苔（右）凝集結(jié)果（左側(cè)為對照）1、由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可看到，生理鹽水一端不出現(xiàn)凝集，福氏志賀菌診斷血清一端菌液渾濁，少量絮狀，為陽性。說明粉紅菌為福氏志賀菌。8. 結(jié)論：腸道桿菌科各菌屬生化反應(yīng)鑒別表葡萄糖 乳糖 麥芽糖 甘露醇 蔗糖 半固體埃希菌屬 +志賀菌屬 + +/- -/+ -沙門菌屬 /+ - - +霍亂弧菌 + - + + + +變形桿菌屬 - - +注： + 產(chǎn)酸或陽性， 產(chǎn)酸產(chǎn)氣， - 陰性， +/- 多數(shù)陽性， -/+ 多數(shù)陰性 不確定。常見腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征葡萄糖 乳糖 半固

18、體大腸埃希菌 +福氏志賀菌 + 傷寒沙門菌 + +霍亂弧菌 + +幽門螺桿菌 不分解糖類 +變形桿菌 +對照常見腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，血清學(xué)分析，說明黃色菌落是金黃色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大腸埃希菌；粉紅色菌落是福氏志賀菌。( 二）實(shí)驗(yàn)綜合討論1. 分析：（1）、用普通平板，從膿汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，油鏡下均為 G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌分別是 金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌 。致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白 , 附著于菌體表面 , 形成凝塊。通過血漿凝

19、固酶實(shí)驗(yàn)，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，為致病菌。用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落，顯微鏡下均為 G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產(chǎn)生是因?yàn)槿樘潜环纸猱a(chǎn)酸，酸使伊紅美和藍(lán)紫結(jié)合，產(chǎn)生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現(xiàn)伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)（紫黑色菌落菌種分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅色菌落菌種只能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）半固體動力試驗(yàn)（紫黑色菌落菌種半固體動力試驗(yàn)結(jié)果陽性，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動力試驗(yàn)結(jié)果陰性，無鞭毛） 。對照常見腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，判定它們分別是大腸埃希菌和福氏志賀菌。通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，進(jìn)一步確定其為福氏志賀菌。綜上所述， 紫黑色的細(xì)菌為大腸埃希菌，粉紅色的為福氏志賀菌 。2. 實(shí)驗(yàn)的不足之處：（1）在對膿汁標(biāo)本黃色細(xì)菌（金黃色葡萄球菌）進(jìn)行斜面培養(yǎng)時(shí)，在斜面上呈現(xiàn)出檸檬黃色而非金黃色的菌落，經(jīng)分析認(rèn)為有一下兩種可能：選取平板上的菌落時(shí)，挑到的菌落并非單一細(xì)菌的菌落；接種到斜面培養(yǎng)基時(shí)，接種環(huán)挑選菌落后在空氣中暴露過久