生物藥物白細胞介素

1、白細胞介素-2（別名：T細胞生長因子,TCGF；IL2）劉璇璇 制藥1403 一、簡單介紹白細胞介素-2是趨化因子家族的一種細胞因子。它是由多細胞來源（主要由活化T細胞產生），又具有多向性作用的細胞因子（主要促進淋巴細胞生長、增殖、分化）；對機體的免疫應答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特異性抗原或致絲裂因數(shù)啟動的T細胞增殖 ；能活化T細胞，促進細胞因子產生；刺激NK細胞增殖，增強NK殺傷活性及產生細胞因子，誘導LAK細胞產生；促進B細胞增殖和分泌抗體；激活巨噬細胞?？捎糜谂R床研究和腫瘤治療。類型：糖蛋白；來源：主要由T細胞產生；作用方式：以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮效應；名詞領域：免疫學它的

2、一般性質為：1IL-2的產生細胞IL-2主要由T細胞（特別是CD4+T細胞）有受抗原或絲裂原刺激后合成；B細胞、NK細胞及單核巨噬細胞亦能產生IL-2。2IL-2分子IL-2分子量為15KD，是含有113個氨基酸殘基的糖蛋白，在人類由第4號染色體上的一個基因編碼。IL-2具有一定的種屬特異性，人類細胞只對靈長類來源的IL-2起反應，而幾乎所有種屬動物的細胞均對人的IL-2敏感。 3IL-2受體（IL-2R）IL-2的靶細胞包括T細胞、NK細胞、B細胞及單核巨噬細胞等。這些細胞表面均可表達IL-2R。IL-2R包含3條多肽鏈：1條為鏈，分子量55KD；1條為鏈，分子量75KD；另1條為鏈，分子量

3、64KD。鏈的胞內區(qū)較短，不能向細胞內傳遞信號，而鏈和鏈的胞內區(qū)較長，具有傳遞信號的能力。3種肽鏈單獨與IL-2結合親和力較低，只有同時表達才能產生高度親和力。 二、生產工藝材料和方法1.制備粗制IL2無菌采血，肝素抗凝，用RPMI1640按11將血液稀釋，然后重層于菲可液面上，以1500r/min離心30min，取白細胞層，用RPMI1640洗2次，按1310細胞/ml濃度加入10%胎牛血清RPMI1640，注入一裝有磁棒的大瓶中，置37攪拌培養(yǎng)4天，取出，分裝于50ml離心管中，1500r/min離心20min，棄上清液，將細胞懸浮于1%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，使細胞濃度為106

4、細胞/ml。同時加入純質PHA12g/ml以及多種B淋巴母細胞株，使其濃度為106細胞/ml，37攪拌培養(yǎng)1824h后，取出以1500r/min離心30min，取上清，用045g濾膜過濾除菌，濾液即為粗制IL2。制備精品IL-21、硫酸銨沉淀與真空濃縮透析：在4下將硫酸銨粉末按50%飽和量加入上述粗制IL2中，攪拌2h，12000g離心30min，取上清液，再加入80%飽和硫酸銨，4過夜，次日以12000g離心30min，棄上清液，將沉淀溶于01%PEG6000的12PBS溶液（pH值73）中，置真空負壓濃縮透析器中透析濃縮至所需容量。2、SephadexG100凝膠過濾：用2180cm的過濾

5、柱及PBS（同上），以80ml/h流速過濾。將各管洗脫液用紫外分光光度計280nm檢測其OD值。同時將幾種不同分子量的標準蛋白也用相同條件過濾及檢測其OD值，繪出IL2及標準蛋白OD值的曲線。將各管洗脫液過濾除菌后，作白細胞生物活性試驗，按試驗結果繪出曲線，找出具有最高IL2活性的幾管洗脫液，混合后，作下一步精制。3、BlueSepharose層析：將上述混合后的洗脫液加入BlueSepharose柱中，流速約15ml/h，按每管10ml收集流出液，當樣品全部流出柱中以后，用上述PBS洗滌樣品柱，再用梯度NaCl溶液（從0075mol/L至06mol/LNaCl的PBS溶液）洗脫，按2ml/管

6、收集洗脫液。NaCl溶液梯度及流速均由梯度混合器調節(jié)控制。洗脫完畢后，作各管OD值及NaCl濃度的測定。各管洗脫液過濾除菌后，作出生物活性測定。將峰值前后的數(shù)管洗脫液混合，即為精制的IL2。置-20冰箱保存。檢定1、活性測定用10%胎牛血清RPMI1640將上述IL2稀釋為50%、25%、125%、625%，而后再將每個百分濃度以及100%濃度的IL2倍比稀釋，自12至1128，將每個稀釋度分別加入多孔板的孔中，每孔01ml。然后取CT6細胞株（小鼠的IL2依賴性T細胞株），調整濃度為106細胞/ml，每孔加入01ml，同時用培養(yǎng)基代替IL2作對照。將多孔板培養(yǎng)24h后，取出按每孔1ci的濃度

7、加H3標記胸腺嘧啶核苷繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出后用MESH細胞收集器過濾洗滌細胞，用計數(shù)器測定各孔細胞的cpm。必要時按此結果繪出曲線，確定活性單位。2、蛋白含量測定采用分光光度計，分別測得OD280及OD260，然后按下式計算：蛋白含量（mg/ml）=（144OD280-075OD260）稀釋倍數(shù)。3、毒性試驗及細菌檢查參考胸腺肽制備部分。三、技術狀況IL-2分泌水平的高低與多種疾病有密切關系。IL-2在機體免疫調節(jié)網絡中的核心作用，與其他細胞因子的協(xié)同和拮抗作用，共同完成機體免疫機能的平衡調節(jié)作用；免疫佐劑是一類能促進、延長或增強抗原免疫原性和免疫保護效果的物質。IL-2作為一種免疫增強劑，顯示

8、出極為廣泛的應用前景。hIL-2是研究最多的細胞因子免疫佐劑之一，其在艾滋病的免疫治療和乙型肝炎病毒作為免疫佐劑的應用上取得了良好的效果。IL-2蛋白和狂犬病滅活苗聯(lián)合使用，可以明顯提高疫苗的免疫效果(保護率至少提高25倍)。1.用于腫瘤和感染性疾病的治療2.用于自身免疫性疾病的治療3.白細胞介素-2與精神分裂癥：早期研究提示精神分裂癥患者有細胞免疫功能的紊亂，且認為這種免疫學功能改變可能與精神分裂癥病因有內在聯(lián)系。近十年來，國內外許多學者對精神分裂癥血清和腦脊液進行了白細胞介素-2和可溶性白介素-2受體檢測，較傾向于認為精神分裂癥中存在濃度異常，但改變的方向和程度不完全一樣Ganguli(1

9、989)等認為精神分裂癥血清IL-2水平低于正常人群，這種異?？赡芘c患者的發(fā)病年齡、病期、疾病的嚴重程度、臨床表現(xiàn)及藥物療效等有密切關系。精神分裂癥病人IL-2水平與臨床狀況(復發(fā)或增加復發(fā)危險性)的關系，一致認為腦脊液中IL-2平與精神病復發(fā)相關，無論在藥物治療或停用后，精神病復發(fā)傾向的病人腦脊液中IL-2水平較復發(fā)者明顯增加，而末梢中IL-2水平不受影響，這種變化排除了DA與5-HT影響，具有較高特異性，由此提出可將腦脊液中IL-2水平變化作為預測精神疾病復發(fā)的一個重要指標。近幾年，有關抗精神病藥在精神分裂癥的治療中對IL-2及SIL-2R的影響研究逐漸增多，由于精神分裂癥免疫改變各異，和

10、作者取樣對象、藥物種類等的不同，抗精神病藥對IL-2及SIL-2R的改變的差異性很大，檢測結果亦顯混亂而復雜，另一方面，藥物在IL-2SIL-2R的改變可以幫助認識某些抗精神病藥的副反應如氯氨平的發(fā)熱和粒細胞下降，而且以IL-2為主的細胞因子可能直接介導中樞神經系統(tǒng)的抗精神病作用。由此研究抗精神病藥對IL-2等濃度影響顯得尤為重要。總之，精神分裂癥IL-2SIL-2R在機體內濃度存在異常，且可能與該病年齡、病期、疾病的嚴重程度、臨床表現(xiàn)、藥物種類和劑量，以及療效等有關，各種檢測差異很大，反映了精神分裂癥病因學的異質性，亦說明了精神分裂癥的IL-2的狀態(tài)檢測以及抗精神病藥物作用需作全面系統(tǒng)的評價

11、。4. 白細胞介素-2的基因工程研究：Taniiguchi于1983年首次成功克隆了hIL-2的cDNA，使IL-2的大量生產和研究成為可能。90年代初IL-2在美國問世，1991年，中國科學院海生化研究所和軍醫(yī)醫(yī)學科學院承接了“八五”重點攻關課題一基因重組白細胞介素-2。成功構建了表達IL-2的pL Y-4質粒，表達水平可達50，經純化后蛋白的比活性可達到1.62.2107，此課題于1994年獲一類新藥證書，是我國繼干擾素后第二個正式進入市場的基因工程藥物。此后，利用基因重組技術，分別在大腸桿菌、酵母、猴COS細胞和昆蟲細胞中表達了有活性IL-2，目前人IL-2已經全部采用基因工程的方法生產

12、。IL-2應用廣泛，但其毒副作用比較大。IL-2能產生寒戰(zhàn)、發(fā)熱和乏力的全身性副作用。其對心血管系統(tǒng)的心臟毒性表現(xiàn)為心律失常、心肌缺血、心肌炎和收縮力下降等癥狀。血流動力學的改變是IL-2治療的最嚴重副作用。表現(xiàn)癥狀為全身血管阻力下降，心率增快，心輸出量增加，平均動脈壓下降。因此在臨床使用中一般采用低劑量靜脈注射以維持低水平、低毒性的有效濃度。另外，基因工程IL-2半衰期太短（約2h），影響療效。如何提高其半衰期是研究者比較關注的一個問題。研究者發(fā)現(xiàn)對IL-2進行氨基酸殘基突變能有效的提高與IL-2R的結合效率，以延長IL-2的半衰期，這是從分子機制上延長半衰期的方法。從制劑的角度出發(fā)同樣能緩

13、解這個問題。目前大量開展了“緩釋制劑的研究，如采用脂質體包裹或M-PEG連接等均可延緩IL-2的半衰期。IL-2融合蛋白已經成為IL-2研究的熱門方向。采用基因重組融合蛋白的方 式獲得IL-2的融合蛋白同樣也能延緩IL-2的半衰期而減少用藥量，同時減少了毒副作用。如抗體-IL-2融合蛋白比IL-2單獨應用的生物活性更好，其抗體部分帶引融合蛋白靶向性結合腫瘤細胞，在腫瘤細胞周圍形成高濃度區(qū)，從而減少了用藥劑量，也相應減少了IL-2引發(fā)的副作用。其融合蛋白還可以激活LAK細胞共同殺傷腫瘤細胞等，并且效果更強。國內外都有相關報道。Belmont等人構建表達的可溶性TCR/IL-2融合蛋白能有效的抑制

14、腫瘤細胞的增殖分化，延長IL-2在體內的半衰期，最小限度的減少了藥物毒性，其抗癌活性遠遠超過單獨使用人IL-2的效果。融合IL-2蛋白具有活性高、毒性小等優(yōu)點，已經成為IL-2研究的一條重要研究途徑。4、 市場發(fā)展概況1.腎癌、惡性黑色素瘤、結腸癌等。2.與LAK、手術、放療、化療相結合用于小腦星形細胞瘤、舌癌、喉癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌和胃癌手術轉移的患者。3.癌性胸腹水。因癌癥患者IL-2的產生能力低下，注入IL-2可激活體內免疫活性細胞而產生抗癌作用。且給IL-2的途徑不同所產生的抗癌效果也不同。迄今臨床應用表明，對于中、晚期惡性腫瘤病人，經常規(guī)手術、化療、放療無效或現(xiàn)仍缺乏有效療法者，采

15、用IL-2和LAK治療，可獲一定客觀療效。 IL-2在畜禽業(yè)中的應用前景由于雞的IL-2的研究不但在研究雞免疫系統(tǒng)的發(fā)生及免疫調節(jié)機理中具有重要作用，而且在人類和哺乳動物的比較免疫學、生物發(fā)育和進化的研究中具有重要意義，因此，國內外學者對雞的IL-2進行了不懈的研究，某些方面已取得了突破性的進展。傳染性法氏囊病(IBD)是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的三大傳染病之一，該病的病原傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要侵害雛雞的中樞免疫器官法氏囊中的B淋巴細胞，導致免疫抑制。近年來，由于變異株和超強毒株的流行，經常導致免疫失敗?；蛎庖叩陌l(fā)現(xiàn)為傳染性法氏囊病的防治提供了一條新思路。目前常用將抗原基因與細胞因子質

16、粒聯(lián)合注射或融合共表達的方法來增強DNA疫苗的免疫效果，其中以IL-2的應用最為廣泛，哺乳動物的IL-2已被廣泛用作DNA疫苗的免疫增強劑。從最近結果來看，雞的IL-2能增強IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性。這為研制新一代禽類疫苗免疫增強劑奠定了基礎。馬立克氏病(MD)是由B群皰疹病毒引起的、具有高度接觸傳染性的腫瘤性疾病。MD主要危害雞、火雞和雉，是世界矚目的禽病之一，對養(yǎng)禽業(yè)有著巨大的威脅。近年來，科學家們又從分子免疫學變化來探討MD的發(fā)病機理。研究發(fā)現(xiàn)：1日齡雛雞人工感染vMDV后，脾臟T淋巴細胞IL-2誘生活性比健康對照雛雞顯著降低(P005)，脾臟和胸腺T淋巴細胞IL-2R誘導表

17、達顯著減少(P001，P005)。同時也有研究發(fā)現(xiàn)：雛雞經MD三價疫苗免疫后，脾臟和胸腺T淋巴 細胞IL-2誘導活性比未免疫健康對照雛雞和火雞皰疹病毒(HVT)疫苗免疫雛雞顯著升高(P001，P001和P001，P001)。因此，IL-2在MD免疫中發(fā)揮了一定作用，這同樣也為新型細胞因子家禽疫苗免疫佐劑的研制奠定了理論基礎。 IL-2在其他抗感染免疫中同樣也發(fā)揮作用。剛孵化出的小雞的T淋巴細胞未發(fā)育成熟，在抗原的刺激下，不能分化增殖和分泌IL-2，因此在小雞兩周齡注射IL-2可以提供一定的保護力。作為免疫治療劑，IL-2還可以克服免疫抑制以及預防某些疾病感染，合理的使用IL-2還可以克服飼料中的霉菌毒素等原因引起的免疫抑制。這些為探討禽類新型重組基因疫