王鴻利 遺傳性凝血因子和抗凝因子缺陷

1、上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院 上海血液學(xué)研究所 王鴻利 王學(xué)鋒 等,遺傳性凝血因子和抗凝因子缺 陷癥的診斷與血友病A的基因治療,研究背景,研究背景,遺傳性凝血因子缺陷癥和抗凝因子缺陷癥分別導(dǎo)致遺傳性出血病和血栓病 患者往往自幼發(fā)病，持續(xù)終生，致殘率高、危害性大、甚至導(dǎo)致死亡，并遺傳至后代 替代治療仍是目前唯一有效的治療手段，基因治療是根治本病的最佳選擇,研究內(nèi)容,研究內(nèi)容,研究對象,q,p,研究對象,研究方法,家系資料,實驗表型,基因診斷,臨床資料,體外表達研究,臨床診斷,臨床治療,研究流程,出血病 以血友病A為例 出血為特征 大關(guān)節(jié) 肌肉 腰大肌 內(nèi)臟 皮膚粘膜 皮膚淤斑 顱內(nèi)出血,研究方法-臨

2、床診斷,研究方法-臨床診斷,血栓病 以抗凝血酶 缺陷癥為例 淺靜脈炎 深靜脈血栓 內(nèi)臟靜脈血栓 肺栓塞,研究方法-家系調(diào)查（FVIII),研究方法-家系調(diào)查（FVII),研究方法-家系調(diào)查（AT缺陷癥),研究方法-篩選試驗和表型診斷實驗,1. 凝血因子缺陷癥篩選試驗：,APTT，PT正常：因子VIII缺陷癥 （血友病A）、因子IX缺陷癥（血友病B）、因子XI缺陷癥 因子XII缺陷癥 APTT正常，PT：因子VII缺陷癥 APTT，PT：因子X缺陷癥、因子V缺陷癥、凝血酶原缺陷癥、纖維蛋白原（Fg）缺陷癥 APTT正常，PT正常：因子XIII缺陷癥,研究方法-篩選試驗和表型診斷實驗,2.vWD篩

3、選試驗：,BT APTT FVIII:C,3. 抗凝因子缺陷篩選試驗：,APCR proGlobal試驗,研究方法-篩選試驗和表型診斷實驗,4. 凝血因子缺陷癥表型診斷試驗：,Fg(clauss法) FII:Ag FII:C FV:Ag FV:C FVII:Ag FVII:C FVIII:Ag FVIII:C FIX:Ag FIX:C FX:Ag FX:C FXI:Ag FXI:C FXII:Ag FXII:C FXIII:Ag FXIII:C vWFR:cof vWF:Ag 多聚體分析,研究方法-篩選試驗和表型診斷實驗,AT:A AT:Ag PC:A PC:Ag TPS:A FPS:A t-

4、PA:A t-PA:Ag PAI:A PAI:Ag PLG:A PLG:Ag 2-AP:A 2-AP:Ag TAFI:A TAFI:Ag,5. 抗凝因子缺陷癥的表型診斷試驗：,研究方法-分子（基因）診斷,DNA/RNA抽提,RFLP,PCR擴增（RT-PCR、ASPCR）,直接核酸測序,DGGE,檢測流程,研究方法-分子（基因）診斷,研究方法-分子（基因）診斷,研究方法-分子（基因）診斷,3.因子VIII缺陷癥（血友病A）：,基因位點檢測：BclI、CA13、CA22的STR以及DXS52（ST14）陽性率49% 直接測序 陽性率100,研究方法-分子（基因）診斷,4.因子IX缺陷癥（血友病B

5、）：,用長距離PCR（LD-PCR）測定 DXS102、 DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094 和DXS1227等6個位點的STR作基因分析，陽 性率達100%,研究方法-分子（基因）診斷,5.其他凝血因子缺陷癥：無（異常）纖維蛋白原血癥、凝血酶原缺陷癥、因子V、VII、X、 XI、XII、 XIII缺陷癥,采用PCR擴增所有外顯子及其側(cè)翼序列，基因測序的方法進行基因診斷 采用限制性酶切分析（RFLP)或等位基因特異性PCR（ASPCR）對發(fā)現(xiàn)的基因突變進行驗證,研究方法-分子（基因）診斷,6.抗凝因子缺陷癥：AT缺陷癥、PC缺陷癥、 PS缺陷癥,采用PCR擴增所有外

6、顯子及其側(cè)翼序列，基因測序的方法進行基因診斷 采用限制性酶切分析或ASPCR對發(fā)現(xiàn)的基因突變進行驗證,轉(zhuǎn)染真核細胞,生物代謝標記,活性與抗原檢測,免疫熒光染色,Western印跡,構(gòu)建突變基因cDNA的表達載體,研究方法-體外表達研究,研究流程,Hewitt J,et al.Severe FVII deficiency caused by a new point mutation combined with a previously undetected gene deletion. Br J Haematol. 2005;128(3):380-5.,研究方法-體外表達研究,其他研究:,根據(jù)突

7、變位點的特殊性，設(shè)計特異性的功能研究試驗 例如針對在信號肽或糖基化位點發(fā)生的突變等，可采用體外無細胞蛋白翻譯試驗，研究突變導(dǎo)致缺陷癥的詳細分子發(fā)病機制,PCR擴增,外周血DNA抽提 （攜帶者）,羊水DNA抽提 （胎兒）,直接核酸測析,間接聯(lián)鎖分析,明確診斷,內(nèi)含子1,22倒位,研究方法-血友病攜帶者和產(chǎn)前診斷,Lavery S.Preimplantation genetic diagnosis: new reproductive options for carriers of haemophilia. Haemophilia. 2004;10 :126-32,研究流程,傳統(tǒng)方法：采集羊水,單細

8、胞植入前診斷,研究方法-攜帶者和產(chǎn)前診斷,研究方法-血友病攜帶者和產(chǎn)前診斷,傳統(tǒng)方法,血友病A F內(nèi)含子22倒位（INV22）、DXS52、Bcl、內(nèi)含子13 （CA13）和內(nèi)含子22（CA22）等5個基因位點進行檢測 血友病B 應(yīng)用DXS102、DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094和DXS1227等6個位點的STR作基因分析,體外受精,胚胎發(fā)育6-8細胞,12個單卵裂球細胞,FVIII/IX基因分析,正常胚胎植入宮內(nèi),活檢取單個細胞,單細胞PCR技術(shù),植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）,研究方法,研究結(jié)果與討論,凝血因子性質(zhì),抗凝因子性質(zhì),凝血/抗凝因子機制,國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,國內(nèi)外研究現(xiàn)狀(PGD),國際報道45種相關(guān)基因突變,國內(nèi)首次報道38種相關(guān)基因突變,突變基因的體外表達研究,時瑞杰,血友病A的基因治療,血友病A基