第十章酶在食品分析中的應(yīng)用ppt課件

1、第10章 酶在食品分析中的應(yīng)用,主要內(nèi)容： 1 酶法分析的特點及應(yīng)用類型 2 酶聯(lián)免疫測定（ELISA） 3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 4 酶生物傳感器 5 酶抑制率法,酶法分析的發(fā)展,酶在定量分析中的應(yīng)用可以追溯到19世紀(jì)中期。當(dāng)時，曾采用麥芽提取物作為過氧化物酶源，以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測定過氧化氫。 然而，酶法分析真正的發(fā)展應(yīng)歸于它在臨床實驗室中的廣泛應(yīng)用。,酶法分析的發(fā)展,如早在1914年臨床上就開始采用脲酶測定尿中的尿素，但是在臨床實驗室中酶分析的真正突破要推遲到1958年，當(dāng)時轉(zhuǎn)氨酶分析發(fā)展成為診斷肝病和心臟病的一個有效手段。 到了20世紀(jì)50年代前已有60種物質(zhì)能借助于酶法

2、分析。近年來，酶法分析發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗、食品、環(huán)境等生物及其它樣品的檢測。,1. 酶法分析的特點及應(yīng)用類型,酶的特性,酶法檢測的特點,催化效率高,專一性,靈敏性強(qiáng),快速,特異性、準(zhǔn)確,不需要物理分離，干擾少,酶在食品分析中的應(yīng)用類型,1）去除樣品中的雜質(zhì)。如測定果糖、多糖等。 2）催化待測物生成新的產(chǎn)物，而這種產(chǎn)物更容易被定量分析。如：淀粉的測定。 3）測定食品中酶的活性作為食品的指標(biāo)，如過氧化物酶的測定、蜂蜜中酶的測定。 4）利用酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生的一些信息。如酶聯(lián)免疫法、酶電極法等。,2 酶聯(lián)免疫測定（ELISA）,酶聯(lián)免疫測定（enzyme-linked immunosorbe

3、nt assay ，ELISA）是繼放射免疫測定技術(shù)之后發(fā)展起來的一項新的免疫學(xué)技術(shù)。 ELISA自上世紀(jì)70年代出現(xiàn)開始，就因其高度的準(zhǔn)確性、特異性、適用范圍寬、檢測速度快以及費用低等優(yōu)點，在臨床和生物疾病診斷與控制等領(lǐng)域中倍受重視，成為檢驗中最為廣泛應(yīng)用的方法之一。,2.1 ELISA的基本原理,（1）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接（或建立關(guān)聯(lián)）。 （2）通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。 它將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高度專一性有機(jī)地結(jié)合起來，可對生物體內(nèi)各種微量有機(jī)物的含量進(jìn)行測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。,重點,ELISA試劑盒的組成,完整的ELISA試劑

4、盒包含以下各組分： （1）包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）； （3）酶作用的底物（顯色劑）； （4）陰性和陽性對照品（定性測定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定）； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液；（含吐溫20磷酸鹽緩沖液） （7）酶反應(yīng)終止液。（常用硫酸）,必需,酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板,DNM-9602A酶標(biāo)分析儀,酶標(biāo)板,2.2 ELISA的基本類型,隨著ELISA在生物檢測分析領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，逐漸演變出了幾種不同類型的檢測方法：,（5）捕獲法測IgM抗體； （6）ABS-ELISA法； （7）P

5、CR-酶聯(lián)免疫測定法； （8）斑點免疫酶結(jié)合試驗。,（1）夾心法； （2）間接法； （3）競爭法； （4）雙位點一步法；,雙抗體夾心法,此法常用于測定抗原, 將已知抗體吸附于固相載體, 加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測定。,（1）雙抗體夾心法,乙肝表面抗原。,間接法,此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測定。,（2）間接法ELISA,競爭法,此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例, 將抗原吸附于固相載體；加入待測抗原和一定

6、量特異性抗體，使固相抗原與待測抗原二者競爭與抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的抗體與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。,（3）競爭法,黃曲霉素,2.3 ELISA測定中酶的作用,由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定具有極高的靈敏度。,（1）酶標(biāo)記的抗體或抗原的制備,酶標(biāo)記的抗體或抗原是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗體或抗原的免疫活性。 酶標(biāo)記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法兩種方法。酶結(jié)合物一般需經(jīng)離子交換層析或分子篩分離純化。,（2）常用的酶及底物,為什么辣根過氧化物酶可應(yīng)用于elisa？,為什么辣根過氧化物酶可應(yīng)用于elis

7、a？,（1）成本低 （2）熱穩(wěn)定性好 （3）顯色反應(yīng)類型多,2.4 ELISA技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用,近年來，ELISA因其操作程序的規(guī)范化、簡單化和檢測的高靈敏性，在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、重要有機(jī)物污染、生物毒素、食品添加劑和人畜共患疾病病原體的快速檢測和分析等食品安全性檢測領(lǐng)域正逐步推廣應(yīng)用。,（1）毒素檢測,真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其中的十幾種對人類危害較大，它們一般同時具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點。其中毒性最大、致癌能力最強(qiáng)的是黃曲霉毒素。它在自然界中分布十分廣泛，黃曲霉常常和其他多種微生物在一起，生長在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。,自1977年抗黃曲霉素B1的單克

8、隆問世至今，幾乎所有重要真菌毒素如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA 檢測方法均已建立。 在對黃曲霉素B1(AFT B1)的檢測中，其檢測AFT B1的線性范圍0.255.Og/mL，靈敏度為12.5 Pg，整個測定過程僅為4h。另外該方法也正在被廣泛地應(yīng)用于各種藻類和貝類毒素的檢測。,黃曲霉素B1 ELISA試劑盒,本試劑盒包括用于定量檢測黃曲霉素B-G的試劑和方法。 檢測數(shù)量：96孔（包括標(biāo)準(zhǔn)） 檢測時間：20分鐘,金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測,蘑菇罐頭約占我國罐頭出口量的30，中國蘑菇罐頭一度占據(jù)美國市場2/3份額，1989年以來FDA以我國蘑菇罐

9、頭食品含有金黃色葡萄球菌腸毒素并導(dǎo)致消費者傷害為由，對中國蘑菇罐頭采取”自動扣留措施”。2002年才得以解決。 FDA檢測蘑菇罐頭葡萄球菌腸毒素使用的TECRA試劑盒在檢測過程中會產(chǎn)生強(qiáng)烈的非特異反應(yīng)，因此，這種試劑盒是不可靠的，其所得出的檢測結(jié)果也是不可靠的。,（2）農(nóng)藥殘留檢測,酶聯(lián)免疫測定已成為許多國際權(quán)威分析機(jī)構(gòu)如AOAC分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止，應(yīng)用酶聯(lián)免疫測定檢測食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA檢出下限為0.07g/mL，與色譜法測定的結(jié)果一致。,從目前來看，盡管ELISA檢測限度還不能完全達(dá)到國外發(fā)達(dá)國家技術(shù)法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，而且抗體制

10、備不易和不能同時完成多種農(nóng)藥殘留檢測等缺點，但是由于該技術(shù)具有樣本前處理簡單，純化步驟少，大量樣本分析時間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場篩選等優(yōu)點，使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)、蔬菜批發(fā)市場和海關(guān)配備，工商人員可隨身攜帶或建立固定的農(nóng)藥殘留速測點，隨時把殘毒超標(biāo)的蔬菜、水果杜絕在食用之前。,（3）細(xì)菌污染檢測,食品中的有害細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定數(shù)目，食用后會引起各種疾病。為了有效地控制其傳播，就必須有快速和可靠的檢測方法。目前有許多種方法，其中通過制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的酶聯(lián)免疫測定技術(shù)研究最多，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。,沙門氏菌的ELISA檢測,例如對沙門氏菌最低檢測量可達(dá)500CFU/g，僅需22h，比常規(guī)方法縮

11、短了34 d，與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應(yīng)。此外以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動沙門氏菌檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了整個過程的自動化，全程耗時僅為45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內(nèi)面，可以從前增菌液中吸附被檢的沙門氏菌，對于該系統(tǒng)來說，需要做的只是加樣。,李斯特氏菌的快速檢測,在對李斯特氏菌的快速檢測中，利用三株針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗，以夾心ELISA法，在48h內(nèi)，可從人工模擬肉中檢測下限為5CFU/g樣品。,（4）肉類品質(zhì)檢測,ELISA在肉類食品品質(zhì)檢測中的應(yīng)用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測兩個方面。腸道疾病的爆

12、發(fā)和動物性食品有很大關(guān)系，而肉食品加熱煮制不當(dāng)是引起該疾病爆發(fā)的一個主要原因。在加熱過程中一些成分的含量會降低，而一些產(chǎn)物的濃度會提高。,當(dāng)用蛋白質(zhì)做指示劑時，可制備抗體，這種抗體對單一蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有專一性，這樣它就可以指示蛋白質(zhì)在加熱過程中變化。因而ELISA可作為商業(yè)上快速判定分析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對乳酸脫氫酶的免疫檢測。其次是對摻入異種肉的檢測，利用多克隆抗體對血清白蛋白的酶聯(lián)免疫測定法，對鮮肉進(jìn)行摻假檢測。,幾種以單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA反應(yīng)已得到應(yīng)用，可以檢測出1%2%的摻假率。目前在商業(yè)上，酶聯(lián)免疫測定已可以檢測十多種動物肉，該方法已為美國農(nóng)

13、業(yè)部使用。同時，ELISA技術(shù)也可以利用對熱穩(wěn)定的肌肉抗原來檢測加熱處理后的肉摻假情況。目前，該技術(shù)可以檢測6種家畜熟肉制品。,（5）動物性食品中藥物殘留檢測,利用ELISA技術(shù)測定動物性食品中有害殘留成分只是近幾年的事。隨著研究的深入，由原樣品的復(fù)雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過程，加速了其在實際檢測中的應(yīng)用。特別是對豬肉、禽肉和水產(chǎn)品中重要禁用獸藥的檢測。,如瘦肉精（鹽酸克倫特羅）酶聯(lián)免疫檢測法，基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競爭性抑制測定，不僅可作為一個定性篩選過程，也可以進(jìn)一步進(jìn)行定量測定。檢測靈敏度可達(dá)到0.510-9，完全達(dá)到我國農(nóng)業(yè)部目前的110-9監(jiān)督檢測標(biāo)準(zhǔn)。ELISA法作為鹽酸克倫

14、特羅殘留量的篩選方法具有操作簡便、準(zhǔn)確快速的特點，適用于大量樣品的測定，并可能成為國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。,（6） 人畜共患疾病病原體檢測,在禽流感病毒檢測方面，我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已形成試劑盒生產(chǎn)能力。此外，采用ELISA法可以有效檢測牛及羊朊病毒蛋白，該蛋白可引起牛的病理性海綿狀病毒，是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ǒ偱２?，BSE），與人群發(fā)生變異型克雅氏?。╒CJD）有關(guān)。,（7） 重金屬污染檢測,金屬硫蛋白遍存于自然界，細(xì)菌、植物、動物以及人類肌體中，是一類對重金屬離子有很強(qiáng)親和力，含豐富的半胱氨酸（約1/3

15、），不含芳香族氨基酸和組氨酸的低分子量蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白含有大量的-SH，能與Hg、Cd、Cu、Ag等重金屬離子結(jié)合掩蔽金屬的毒性，對細(xì)胞內(nèi)的金屬離子有重要的解毒作用。,生物細(xì)胞，在環(huán)境受重金屬污染（Cu、Hg、Cd、Pb、Zn與金屬離子）的情況下，可被誘導(dǎo)合成出大量的金屬硫蛋白，且在一定范圍內(nèi)成正比，是一項對金屬污染具特異性的指標(biāo)。用純化的金屬硫蛋白對兔進(jìn)行免疫，兔抗血清純化后并標(biāo)記辣根過氧化酶，可實現(xiàn)對食品中重金屬污染的超微量檢測。,（8） 食物中其它成分檢測,ELISA技術(shù)同時可以用于食品中其它成分的檢測，如:(1)檢測某些特定的轉(zhuǎn)移基因表達(dá)蛋白，以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基

16、因成分；（2）食品中營養(yǎng)素的測定，最小檢出限可達(dá)0.05g/g；（3）通過合成不同異黃酮的羥酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4）可用于檢測食品加工過程中的酶（如磷酸丙糖異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）含量的變化等。,2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）,PCR檢測的原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）以特定的基因片段為模板，利用人工合成的一對寡聚核苷酸為引物，以四種脫氧核苷酸為底物，在DNA聚合酶的作用下，通過DNA模板的變性，達(dá)到基因擴(kuò)增的目的。PCR是目前轉(zhuǎn)基因食品檢測較為成熟的方法。,我國已應(yīng)用PCR- 酶聯(lián)免疫測定檢測技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)基因大豆與玉米中常

17、用外源基因的快速檢測體系，并應(yīng)用于進(jìn)出境產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測實際工作中，結(jié)果表明，PCR-酶聯(lián)免疫測定法具有操作簡便、靈敏特異、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點，可對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米及其它轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性和定量檢測。,PCR檢測的應(yīng)用,對熱處理后的熟肉樣品，要檢測出肉制品中肉的組成比較困難，但經(jīng)PCR后檢測，牛肉、豬肉、雞肉和火雞肉的最小檢測量可以達(dá)到1%2 %，而且肉制品中的抗壞血酸添加劑不影響檢測結(jié)果。目前，PCR是區(qū)分雞肉和火雞肉的唯一方法。PCR也用于食品中腐敗菌、病原菌如腸道出血性大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、金黃色葡萄球菌等的檢測。,3酶生物傳感器,酶傳感器主要利用它對生物體的催化特性，且對特定底物有反應(yīng)

18、的特異性，把這種特異性與電化學(xué)分析的迅速性和簡便性結(jié)合起來，從含有多種多樣有機(jī)物的生物試樣中，有選擇地把特定物質(zhì)迅速測定出來。,酶生物傳感器的簡圖,C6H12O6 + O2 C6H12O7 + H2O2,酶傳感器的優(yōu)點,它還具有能反復(fù)進(jìn)行，不需要通常進(jìn)行酶分析時需要的酶和顯示劑，實現(xiàn)無試劑分析，因此，發(fā)展較快，現(xiàn)已有多酶傳感器，可用在生產(chǎn)線上監(jiān)控食品加工流程、發(fā)酵工藝過程及微生物濃度的控制，又可在包裝材料上測知食品是否經(jīng)過不當(dāng)溫度的貯存，冷凍時微生物含量及貯存壽命的預(yù)警。,酶生物傳感器在食品分析中的應(yīng)用,利用酶電極進(jìn)行食品分析，已能測定多種氨基酸和一些糖類，如：用脲酶電極法測定食品中賴氨酸含量。由固定化蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖變旋酶及葡萄糖氧化酶的復(fù)合酶膜組成的過氧化氫雙電極系統(tǒng)，可同時測定樣品中蔗糖和葡萄糖的含量，具有操作簡單，測定快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，儀器穩(wěn)定性好，酶膜使用壽命長的特點，一次進(jìn)樣可同時測定樣品中蔗糖和葡萄糖的含量，而且樣品無需特別處理。該方法適用于食品發(fā)酵液中蔗糖和葡萄糖的測定。,酶電極在食品行業(yè)中的應(yīng)用,（1）在釀酒過程中，將乙醇酶和葡萄糖氧化酶固定成酶膜，與電極連接，制成的生物傳感器可監(jiān)控葡萄糖和乙醇的濃度； （2）利用嘌呤氧化酶