SDSPAGE原理下[共7頁]

1、電泳槽,SDS-PAGE蛋白電泳上樣緩沖液,蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一種以溴酚藍為染料，5倍濃縮的SDS-PAGE凝膠電泳上樣緩沖液,用于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白電泳樣品上樣。 本產(chǎn)品分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶，選購和使用時請務(wù)必注明，仔細區(qū)分。 注意事項 分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中含一定量的DTT或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，較易區(qū)分； 含巰基的試劑有一定的毒性，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套

2、操作。 使用說明 1. 按每4微升蛋白樣品加入1微升蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。 2.100或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 3.冷卻到室溫后離心數(shù)秒鐘，混均后再離30秒鐘，取上清直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 4.通常電泳時染料到達膠的底端附近（0.5-1cm)即可停止電泳,增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。 上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴散出來到電泳緩沖液中。 指示劑監(jiān)測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿

3、,SDS-PAGE蛋白電泳上樣緩沖液,考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue） 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍G250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beers law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，

4、蛋白質(zhì)染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質(zhì)5L/ml時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10100g蛋白質(zhì)，微量測定法測定范圍是110g蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好，精確度高，線性關(guān)系好。標準曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定,考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250） 測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為01 000gmL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法,Triton-100 Triton-10